梅毒螺旋體慢性持續(xù)性感染相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展

湯蘭桂 江晗 張曉紅 趙飛駿

梅毒是由梅毒螺旋體（Treponema pallidum，Tp）所致的一種臨床表現(xiàn)復(fù)雜、可階段式發(fā)展、晚期可導(dǎo)致多臟器病理損害的人類性傳播疾病，嚴(yán)重威脅公眾健康。Tp 因其公認(rèn)的早期傳播及強(qiáng)大的免疫逃逸能力被稱為“隱形病原體”。到目前為止實(shí)驗(yàn)室仍然無法對其進(jìn)行人工培養(yǎng)和遺傳操作，Tp 致病機(jī)制的研究尚存在許多障礙。獲益于Tp 全基因組序列的破解以及蛋白重組技術(shù)的普及，近年來，在Tp 蛋白質(zhì)組、細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及生理、代謝和調(diào)節(jié)等方面已經(jīng)取得了較大進(jìn)展。本研究整合了有關(guān)Tp致病機(jī)制的相關(guān)研究，期望從多方面描述Tp 造成慢性持續(xù)性感染的相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)綜述如下。

1 Tp 特殊的生理代謝途徑

Tp 的發(fā)現(xiàn)可以追溯到1906年，但是至今沒有找到有效的體外連續(xù)傳代培養(yǎng)的方法，目前仍然主要依靠建立兔感染模型來進(jìn)行相關(guān)研究。Tp 只有在宿主體內(nèi)營養(yǎng)豐富、高度穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境中才能獲得所有必需的營養(yǎng)素得以正常增殖、傳代。高度適應(yīng)的寄生生活使得Tp 缺乏核苷酸、脂肪酸、維生素、輔因子、氨基酸、三羧酸循環(huán)以及氧化磷酸化等從頭合成的相關(guān)基因[1]，進(jìn)化出螺旋體中最小的基因組，同時(shí)也是基因組最小的致病菌之一。通過生物信息學(xué)的分析技術(shù)可以預(yù)測Tp 基因組大約編碼400 多種蛋白質(zhì)。較小的基因組序列大大減少了抗原性物質(zhì)的表達(dá)，從而減少Tp 被免疫系統(tǒng)清除的機(jī)會。有報(bào)道[2]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，潛伏期的Tp 可在家兔的毛囊以及神經(jīng)組織中寄生，從而躲避免疫系統(tǒng)的清除，形成慢性持續(xù)性的感染。

2 固有免疫應(yīng)答系統(tǒng)

LPS（Lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜高度促炎性糖脂，Tp 外膜缺乏脂多糖。研究表明[3]在Tp 感染的過程中，Tp 的多種膜脂蛋白能通過Toll 樣受體2（TLR2）依賴的信號傳導(dǎo)途徑激活病灶內(nèi)的固有免疫細(xì)胞，主要是巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC）。然而進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要定位于Tp 細(xì)胞膜的內(nèi)膜上[4]，導(dǎo)致通過表面暴露的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）對體內(nèi)Tp 的清除效果有限。這種特殊的結(jié)構(gòu)使得Tp 能夠有機(jī)會躲避固有免疫應(yīng)答系統(tǒng)的識別清除而反復(fù)傳播。同時(shí)這也在一定程度上解釋了為何Tp 感染缺乏感染性疾病特有的全身性炎癥癥狀[5]。

3 適應(yīng)性（特異性）免疫應(yīng)答系統(tǒng)

按照特異性免疫應(yīng)答的發(fā)展規(guī)律，機(jī)體調(diào)理抗體的出現(xiàn)，吞噬細(xì)胞可通過抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）吞噬Tp，并且通過相關(guān)信號傳導(dǎo)促進(jìn)溶酶體內(nèi)螺旋體的內(nèi)化、殺滅和降解。早期的實(shí)驗(yàn)通過既往感染梅毒的家兔血清進(jìn)行被動(dòng)免疫后再接種Tp，已經(jīng)證明特異性抗體在潛伏期間抑制Tp 負(fù)荷起關(guān)鍵作用。然而Ceuz 等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，在繼發(fā)性和早期潛伏梅毒期間，盡管有高滴度的抗密螺旋體抗體存在，Tp 仍然能夠在宿主體內(nèi)存活。Tp 是如何躲避宿主特異性免疫系統(tǒng)的殺傷清除，形成慢性持續(xù)性的感染，目前報(bào)道主要有以下幾種機(jī)制。

3.1 外膜蛋白表達(dá)稀少上世紀(jì)80年代通過冷凍電鏡發(fā)現(xiàn)Tp的外膜蛋白含量（outer membrane proteins，OMPs）相比大腸埃希菌少約100 倍，稀少的外膜蛋白降低了其被機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)并清除的幾率，但同時(shí)也限制了Tp 新陳代謝的效率，從而抑制了Tp 在宿主體內(nèi)增殖的速率。外膜蛋白Tp0326（最初被稱為Tp92）歸屬于β-桶體組裝機(jī)械蛋白A（β-barrel assembly machinery protein A，BamA）蛋白家族，在Tp 基因組中，有且只有Tp92 基因與革蘭氏陰性菌的外膜蛋白基因序列具有高度同源性[7]。Tp92 蛋白定位于細(xì)胞膜表面，序列恒定，預(yù)測應(yīng)該可以刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的抗體。有報(bào)道[8，9]以納米殼聚糖顆粒為載體，IL-2 為佐劑，將pcDNA3.1（+）/Tp92 疫苗接種于新西蘭兔，發(fā)現(xiàn)Tp92 疫苗能刺激試驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，但是保護(hù)作用有限，這與其在Tp 中的表達(dá)含量較低有關(guān)。Tpr 蛋白家族的組成有12 個(gè)（TprA-L）重復(fù)的蛋白。根據(jù)氨基酸排布的差異分為Tpr Ⅰ、Tpr Ⅱ、Tpr Ⅲ3個(gè)亞家族。Tpr 蛋白與齒垢密螺旋體（Treponema denticola）的主要外鞘蛋白（MOSP）具有序列同源性，是已知的成孔蛋白和粘附素[10]。通過計(jì)算機(jī)矩陣技術(shù)對Tpr 蛋白家族進(jìn)行篩選，TprC（TP0117）、TprD（TP0131）、TprI（TP0620）均具有細(xì)菌外膜蛋白的顯著特征—β-桶狀結(jié)構(gòu)[11，12]，這些蛋白在Tp 上的表達(dá)豐度也非常低，每個(gè)細(xì)胞只有約200 個(gè)拷貝。對于BamA，TprC/D 和TprI，大多數(shù)抗體針對周質(zhì)結(jié)構(gòu)域[12，13]，因此無法有效清除Tp。對于那些可能具有調(diào)理作用的抗體，目標(biāo)蛋白質(zhì)的極低拷貝數(shù)限制了它們的清除效能。體外實(shí)驗(yàn)[11，13]表明，大百分比的Tp 不能被針對TprC/D 或BamA的高滴度重組抗血清進(jìn)行表面標(biāo)記或調(diào)理。類似的，有研究表明Tp0750-Tp0751 蛋白酶復(fù)合物和TP0435 在一些密螺旋體的表面上低水平表達(dá)[14，15]，因此對抗體結(jié)合的可用性有限。

3.2 表面暴露相關(guān)結(jié)構(gòu)域的缺乏Tp0453 被Hazlett等[16]證實(shí)為整合外膜蛋白，其二級結(jié)構(gòu)主要含28%的α-螺旋和18%的β-折疊，這個(gè)比率與經(jīng)典的整合外膜蛋白相比有較大差異。通過免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Tp0453 蛋白缺乏表面暴露相關(guān)結(jié)構(gòu)域，從而推測這種外膜蛋白的特殊結(jié)構(gòu)組成有利于其逃避宿主免疫反應(yīng)，潛伏在宿主體內(nèi)發(fā)展成為持續(xù)的慢性感染。

3.3 外膜蛋白的異質(zhì)性人們一致認(rèn)為對抗體結(jié)合的抗性是Tp 免疫逃逸的基礎(chǔ)，但早期免疫標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明，Tp 的外膜是抗原性惰性的[17]。后來的生物學(xué)分析證實(shí)了Tp 感染刺激產(chǎn)生了與Tp 外膜蛋白結(jié)合的抗體。有研究表明[18]，在梅毒患者體內(nèi)Tp 可以分為兩個(gè)亞群，一個(gè)亞群可以與抗體結(jié)合，而另一個(gè)亞群不與相應(yīng)的抗體發(fā)生反應(yīng)，并且Tp 菌體結(jié)合抗體后仍然具有一定的動(dòng)力學(xué)特征。Giacani等[19]發(fā)現(xiàn)在不同Tp 菌株之間，存在基因表達(dá)上的差異，并且可以通過這種差異對Tp 菌株進(jìn)行分型。通過對不同來源的Tp 菌株分析發(fā)現(xiàn)，Tp 外膜蛋白亞族成員基因變異現(xiàn)象不同程度的存在，這些觀察結(jié)果證實(shí)體內(nèi)Tp 的清除和存留同時(shí)發(fā)生[18]。在特定的病灶，與抗體結(jié)合的Tp 被緩慢的清除，同時(shí)也刺激著局部炎癥的發(fā)展，而免疫逃避的未結(jié)合亞群將在局部復(fù)制并全身傳播。目前發(fā)現(xiàn)Tp 的抗原異質(zhì)性主要通過以下兩種方式產(chǎn)生：

3.3.1 外膜蛋白基因的多態(tài)性 目前已經(jīng)證實(shí)Tpr基因家族的各成員存在不同程度的易變性，TprⅠ、Tpr Ⅱ、Tpr Ⅲ各亞族基因均具有按不同規(guī)律分布的保守區(qū)及可變區(qū)，從而導(dǎo)致其氨基酸序列呈現(xiàn)高度的變異性。其中TprK（Tp0897）抗原是最早受到關(guān)注的變異性抗原，其屬于Tpr Ⅲ亞族。Tp0897蛋白位于外膜表面[20]，中間區(qū)域氨基酸組成保守，兩側(cè)有7 個(gè)區(qū)域氨基酸序列變化較大，為可變區(qū)（V區(qū)），其還具有一個(gè)包含3～7 個(gè)異質(zhì)區(qū)的中央親水區(qū)（CHR），各異質(zhì)區(qū)序列組成差別較大，且具有一定的種屬特異性。TprK 基因序列不僅在各菌株之間具有高度變異而且在菌株內(nèi)部，其堿基序列也存在高度變異[21]。TprK 基因的7 個(gè)可變區(qū)中包含眾多的復(fù)等位基因，其中基因轉(zhuǎn)換在V6 區(qū)發(fā)生率最高[21]。眾多的復(fù)等位基因構(gòu)成了TprK 蛋白抗原多樣性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在Tp 感染期間，V 區(qū)表位被B細(xì)胞識別，由于TprK 序列的抗原變異，針對TprK V 區(qū)的特異性抗體效用差異巨大，并且抗體滴度也隨著宿主的間的個(gè)體差異而存在較大差別[21]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一觀點(diǎn)，逃避免疫清除導(dǎo)致播散性梅毒疹的Tp 絕大部分（96%）是來源于同一個(gè)TprK 變體；通過比較免疫功能正常與免疫功能抑制兔模型中TprK 抗原變異程度，證實(shí)了機(jī)體免疫抑制也會相應(yīng)減少Tp 感染期間TprK 序列的變異頻率；TprK 蛋白免疫宿主后，宿主針對Tp 菌體的TprK 抗原各表位產(chǎn)生了特異性免疫反應(yīng)，并誘導(dǎo)Tp 產(chǎn)生了新的TprK 變異。這表明在宿主免疫壓力下，TprK 抗原可相應(yīng)持續(xù)變異，原有的或新產(chǎn)生的TprK 抗體均不能識別不斷變化的TprK 抗原從而發(fā)揮有效的免疫清除作用，使得Tp 能夠逃避機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答。對菌株SS14 基因組的重新測序揭示了TprD（Tp0131）在菌株內(nèi)的序列異質(zhì)性[22]，其作為外膜蛋白的β-桶組成部分，表明該Tp 外膜蛋白（OMP）也發(fā)生著抗原變異。此外，Tp0136基因的開放閱讀框（ORF）在Tp 的各個(gè)亞種或菌株之間也被發(fā)現(xiàn)存在高度的多態(tài)性[23]。

3.3.2 外膜蛋白基因的錯(cuò)配 Giacani 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，Tp 外膜蛋白Tpr Ⅱ亞群基因在復(fù)制過程中，緊挨著轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的G 核苷酸重復(fù)數(shù)目的變化會導(dǎo)致滑鏈錯(cuò)配的發(fā)生，從而導(dǎo)致TprE、TprG 和TprJ 在不同的菌株中存在一定的異質(zhì)性。

4 極強(qiáng)粘附及穿透能力

Tp 可以與哺乳動(dòng)物多種細(xì)胞類型以及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白結(jié)合，特別是層粘連蛋白和纖維連接蛋白。通過生物信息學(xué)鑒定技術(shù)并聯(lián)合結(jié)合試驗(yàn)，目前已經(jīng)鑒定的粘附素有纖連蛋白黏附素Tp0155、Tp0435（Tpp17）和Tp0483，和核纖層蛋白黏附素Tp0751[25]。Tp0751 還是一種鋅依賴性金屬蛋白酶，Tp0751 與Zn2+形成的復(fù)合酶，能夠?qū)⒀龎K以及細(xì)胞外的基質(zhì)成分進(jìn)行降解，從而有利于Tp 在機(jī)體內(nèi)感染的擴(kuò)散。Tp0136 是一種脂蛋白，其能與纖連蛋白結(jié)合起到粘附素的作用。目前也已證實(shí)，其在不同的菌株之間存在序列上的異質(zhì)性[23]。這些結(jié)構(gòu)賦予了Tp 極強(qiáng)的粘附及穿透能力。當(dāng)Tp通過皮膚、粘膜或者性活動(dòng)產(chǎn)生的皮膚破裂進(jìn)入機(jī)體，附著于宿主細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的開始其感染的關(guān)鍵步驟，在上皮下方定植以后，Tp 局部繁殖并通過淋巴管和血流傳播至全身。Tp 的彎曲，平波形態(tài)使其能夠穿透整個(gè)身體的組織和血管屏障，配合其周質(zhì)運(yùn)動(dòng)裝置通過前后波動(dòng)[26]可使其順利侵入深部內(nèi)臟、肌肉骨骼以及腦部神經(jīng)組織甚至遠(yuǎn)端的皮膚、粘膜、毛囊等部位，從而躲避免疫宿主免疫系統(tǒng)的清除獲得后續(xù)傳播的機(jī)會。

經(jīng)過漫長的進(jìn)化，Tp 高度適應(yīng)人體內(nèi)的寄生生活，其感染機(jī)制十分復(fù)雜，涉及新陳代謝、結(jié)構(gòu)、基因的表達(dá)及調(diào)控等各方面。深入了解Tp 慢性持續(xù)性感染相關(guān)機(jī)制對于梅毒的治療、診斷抗原的篩選，尤其是梅毒疫苗的研發(fā)有著深刻的指導(dǎo)意義。隨著研究的深入，特別是基因工程、生物信息技術(shù)的廣泛使用，目前對Tp 的結(jié)構(gòu)及蛋白組成都有了比較全面的了解，在這個(gè)過程中對其部分感染機(jī)制有了在分子水平上的合理解釋。但是要全面揭示Tp 在人體內(nèi)如何躲避免疫系統(tǒng)的清除而長期持續(xù)存活，仍然需要長期的探索。