Toll樣受體在糖尿病創(chuàng)面感染中的作用機制及治療進展

劉國濤， 王 軍

流行病學調(diào)查表明中國現(xiàn)有約1.14億糖尿病患者，臨床可見多種糖尿病并發(fā)癥，其中以糖尿病創(chuàng)面的診療費用最高，預后較差；最新統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)50歲以上糖尿病患者1年內(nèi)新發(fā)足潰瘍的發(fā)生率為8.1%，治愈后患者1年內(nèi)再發(fā)足潰瘍的發(fā)生率為31.6%[1]。糖尿病患者的高血糖可增加創(chuàng)面感染發(fā)生率并導致創(chuàng)面愈合延遲，糖尿病創(chuàng)面合并的感染會進一步導致難以控制的高血糖，高血糖進一步加重感染從而形成惡性循環(huán)；同時感染會加重患者機體的炎癥反應(yīng)，治療過程中抗生素的大量使用也會導致創(chuàng)面耐藥菌的產(chǎn)生，帶來巨大的醫(yī)療衛(wèi)生壓力，嚴重影響著患者的生存質(zhì)量[2]。

糖尿病創(chuàng)面愈合延遲的具體機制目前尚未明確，當下認為局部創(chuàng)面感染、炎癥與糖尿病創(chuàng)面的發(fā)展預后密切相關(guān)，其中感染和炎癥反應(yīng)貫穿于糖尿病創(chuàng)面愈合的全過程，控制感染抑制過高的炎癥反應(yīng)是治療糖尿病創(chuàng)面的重要方向。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體（toll-like receptors, TLRs）通路及細胞因子信號傳導抑制因子家族蛋白（suppressor of cytokine signaling, SOCS）可以調(diào)控多種細胞因子的信號轉(zhuǎn)導，在糖尿病創(chuàng)面的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用[3-4]。中醫(yī)中藥對糖尿病創(chuàng)面具有很好的療效，明確其作用機制有助于推動中藥在糖尿病創(chuàng)面治療中的廣泛應(yīng)用[5-6]。本文作者查閱近年來文獻，以TLRs信號通路及SOCS蛋白與糖尿病創(chuàng)面感染和炎癥的關(guān)系為切入點，對近些年來有關(guān)中醫(yī)藥治療糖尿病創(chuàng)面感染的研究進展的作一綜述。

1 TLRs通路和SOCS蛋白在糖尿病創(chuàng)面中的抗感染和抗炎機制

正常的皮膚結(jié)構(gòu)是一個有效的屏障，可以抵御各種病原體侵入。在解剖學上，皮膚由三部分組成：表皮層、富含成纖維細胞的真皮層和真皮脂肪層；角蛋白細胞是主要的表皮細胞類型，其余表皮細胞包括朗格漢斯細胞、黑素細胞、默克爾細胞和浸潤的免疫細胞；成纖維細胞是真皮層中的常駐細胞類型，具有高度異質(zhì)性；真皮下部（網(wǎng)狀）的成纖維細胞有可能與前脂肪細胞結(jié)合并分化為脂肪細胞，形成最后一個也是皮膚最深的屏障[7]。糖尿病創(chuàng)面局部常定植有多種微生物，致病菌以單菌和多重耐藥菌為主。這些微生物多通過TLRs的保守分子模式識別激活人體的抗感染途徑，導致抗菌肽和促炎細胞因子的產(chǎn)生招募并激活骨髓和淋巴免疫細胞，例如中性粒細胞、單核細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞，啟動皮膚防御入侵的反應(yīng)病原體，但是高糖狀態(tài)會導致機體免疫系統(tǒng)的過度激活，創(chuàng)面炎癥水平紊亂，不僅不能清除創(chuàng)面定植的微生物也會導致糖尿病創(chuàng)面愈合延遲[8-9]。

糖尿病創(chuàng)面病原體激活皮膚免疫與TLRs信號通路關(guān)系密切，TLRs屬于病原體相關(guān)模式識別受體家族。TLR是跨膜受體，與細菌和病毒中的特定分子模式結(jié)合，迄今為止，已在人類中鑒定出10種此類受體，其病原體相關(guān)配體包括細菌鞭毛蛋白、病毒DNA、脂多糖和CpG-DNA基序。TLR以單一或異二聚體的形式與MyD88、TRAF6和TIRAP等不同的配位分子結(jié)合形成復合物，在配體結(jié)合時啟動信號轉(zhuǎn)導，下游信號分子如p38、MAPK、JNK和NF-κB被激活并轉(zhuǎn)移到細胞核中，在那里它們激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，如c-Fos和c-Jun，促進一些促炎細胞因子的釋放以產(chǎn)生抗菌和抗病毒反應(yīng)，清除創(chuàng)面微生物從而促進愈合[10]。TLR1協(xié)同TLR2介導糖尿病創(chuàng)面的革蘭陽性細菌脂蛋白或脂肽的天然免疫應(yīng)答，形成激活簇TLR2:TLR1:CD14以響應(yīng)三?；?，該簇從細胞表面觸發(fā)信號，隨后以脂筏依賴性途徑靶向高爾基，通過MYD88和TRAF6發(fā)揮作用，導致NF-kappa-B活化、細胞因子分泌和炎癥反應(yīng)[11]。TLR2除了協(xié)同TLR1和TLR6外，還可激活免疫細胞，促進對脂蛋白脂質(zhì)部分的凋亡；與TLR6協(xié)同識別支原體巨噬細胞激活脂肽-2kD、可溶性結(jié)核因子和酚溶性調(diào)節(jié)蛋白；并能識別結(jié)核分枝桿菌主要T抗原EsxA，根據(jù)配體形成對二酰化脂肽的TLR2:TLR6:CD14:CD36和對三?；牡腡LR2:TLR1:CD14的簇，激活機體對結(jié)核桿菌的免疫[12]。TLR4主要協(xié)同LY96和CD14介導革蘭陰性細菌脂多糖（LPS）的天然免疫應(yīng)答，除通過MYD88、TIRAP和TRAF6作用，導致NF-kappa-B活化、細胞因子分泌和炎癥反應(yīng)外，也參與由游離脂肪酸如棕櫚酸酯和Ni2+引發(fā)的LPS無關(guān)的炎癥反應(yīng)；在與TLR6復合物中，促進單核細胞/巨噬細胞的無菌炎癥反應(yīng)以氧化低密度脂蛋白（oxLDL）或淀粉樣β42。在這種情況下，oxLDL-或淀粉樣β42與CD36結(jié)合提供初始信號，TLR4和TLR6異二聚體形成，該異二聚體迅速內(nèi)化并觸發(fā)炎癥反應(yīng)，導致通過MYD88信號途徑，通過TICAM1信號途徑，通過NF-kappa-B依賴性地產(chǎn)生CXCL1、CXCL2和CCL9細胞因子，以及IL-1β分泌，誘導炎癥細胞因子釋放，清除糖尿病創(chuàng)面的革蘭陰性菌[13]。TLR9是一種核苷酸敏感的TLR，由未甲基化的磷酸胞苷鳥苷二核苷酸（CpG）激活炎癥反應(yīng)，研究表明糖尿病創(chuàng)面形成與TLR9和TLR7通過激活漿細胞樣樹突狀細胞有關(guān)，預示創(chuàng)面的某些細菌的核苷酸參與創(chuàng)面形成[14]。目前未見TLR5、TLR8和TLR10在糖尿病創(chuàng)面方向的研究。以上結(jié)果表明TLRs信號通路主要是識別并傳遞創(chuàng)面微生物感染信號，啟動NF-kappa-B活化產(chǎn)生白細胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-12等介導炎癥反應(yīng)，目的是清除創(chuàng)面微生物然后促進創(chuàng)面愈合；然而糖尿病創(chuàng)面多重耐藥菌的存在導致不必要的炎癥反應(yīng)被激活，影響創(chuàng)面愈合。

TLRs識別不同的病原體相關(guān)分子模式的同時會誘導炎癥基因的表達[15]，同時SOCS家族可以通過抑制JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導通路的激活來實現(xiàn)對炎癥分子的調(diào)控，促進糖尿病創(chuàng)面愈合[16]。SOCS是調(diào)節(jié)細胞因子信號轉(zhuǎn)導的經(jīng)典負反饋系統(tǒng)的一部分，包含SOCS1到SOCS7。SOCS1到6都可以識別ECS（elongin BC-CUL2/5-SOCS-box蛋白）E3泛素連接酶復合物，并介導目標蛋白的泛素化和隨后的蛋白酶體降解；SOCS7 則負責調(diào)節(jié)信號級聯(lián)[17]。SOCS3可特異性與JAK2結(jié)合抑制其激酶活性，作為抗炎調(diào)節(jié)因子抑制STAT3的激活，介導IL-6信號轉(zhuǎn)導調(diào)控巨噬細胞的轉(zhuǎn)型；并參與促紅細胞生成素、胰島素、IL-12、粒細胞集落刺激因子和瘦素受體在內(nèi)的酪氨酸激酶受體結(jié)合，抑制細胞因子信號轉(zhuǎn)導；調(diào)節(jié)T輔助 2 型細胞介導的過敏反應(yīng)的發(fā)生和維持，從而抑制創(chuàng)面愈合[18]。SOCS4和SOCS5 通過介導酪氨酸磷酸化表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）及其受體的降解抑制EGF信號傳導，導致創(chuàng)面愈合延遲[19]。SOCS5還可以通過抑制促進分化為 Th2 表型的 IL-4信號通路參與調(diào)節(jié) T 輔助細胞分化；此外，SOCS5可以促進角質(zhì)形成細胞在愈合階段的遷移和增殖[16]。FENG[15]等人在角質(zhì)形成細胞（HaCaT）和內(nèi)皮細胞（HECV）中檢測到SOCS-3的過度表達和SOCS-4基因敲除突變株，研究發(fā)現(xiàn)過度表達SOCS-3可顯著降低HaCaT角質(zhì)形成細胞的增殖率，增強 HECV 細胞的小管形成能力；SOCS-4基因敲除顯著減少HaCaT 遷移和HECV細胞微管形成，抑制SOCS-4影響HaCaT和HECV細胞對EGF和TGF-β的反應(yīng)性，導致HaCaT細胞磷酸化蛋白表達失調(diào)。以上結(jié)果表明DFUs創(chuàng)面愈合與SOCS-3和SOCS-4關(guān)系密切，SOCS5可能是糖尿病創(chuàng)面愈合過程中新的干預靶點。

2 現(xiàn)代醫(yī)學治療糖尿病感染創(chuàng)面的研究進展

臨床治療糖尿病創(chuàng)面合并感染患者，在保證下肢血液供應(yīng)的同時根據(jù)創(chuàng)面類型使用不同的清創(chuàng)術(shù)清除壞死組織，以控制創(chuàng)面感染[20]。Singh等[21]研究發(fā)現(xiàn)TLR4單核苷酸多態(tài)性 rs4986790、rs4986791、rs11536858、rs1927911和rs1927914與DFU患者風險增加的相關(guān)，通過對125例糖尿病合并DFU患者和130例正常人進行TLR4基因型分析，發(fā)現(xiàn)除rs1927914外，所有單核苷酸多態(tài)性的危險基因型均與DFU顯著相關(guān)。單倍型ACATC（P值=9.3E-5）與DFU風險有很強的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)兩種單倍型ATATC（P值=0.0119）和ATGTT（P值=0.0087）對DFU有保護作用；通過觀察110例2型糖尿?。ɑ颊呦轮珓?chuàng)面TLR2的表達情況，并檢測了TLR2啟動子的甲基化狀態(tài)，結(jié)果表明與對照組相比，2型糖尿病創(chuàng)面TLR2基因表達下調(diào)，但其表達水平隨傷口的感染程度而升高，創(chuàng)面TLR2基因啟動子甲基化狀態(tài)無明顯差異[22]；后期Singh等[14]對84例2型糖尿病患者和6例非糖尿病對照者創(chuàng)面TLR7和TLR9在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的差異表達進行了分析，結(jié)果表明與對照組相比，2型糖尿病患者非感染創(chuàng)面TLR7和TLR9表達明顯上調(diào)，而伴有微生物感染的創(chuàng)面TLR7和TLR9表達水平較低。TLR9-1237T/C基因多態(tài)性是DFU患者的一個危險因素，同時TLR9上調(diào)創(chuàng)面S100A8和IL-8的表達，造成創(chuàng)面的持續(xù)感染[23]。羅麗婭等[24]將DFU患者、無DF患者和健康體檢者進行比較，發(fā)現(xiàn)DFU組患者血清TLR9水平升高的同時，25(OH)D水平降低(P<0.05)，血清中的25(OH)D水平降低可能導致患者免疫功能下降，造成創(chuàng)面持續(xù)感染，難以愈合。上述研究表明，DFU患者創(chuàng)面的感染情況與TLR2/4/9基因的多態(tài)性和表達相關(guān)，這些基因可能是促進DFU患者創(chuàng)面愈合的潛在干預靶點。

3 中醫(yī)藥治療糖尿病創(chuàng)面感染的進展

3.1 中醫(yī)藥治療糖尿病創(chuàng)面感染的臨床研究進展 傳統(tǒng)療法在注重“整體”治療的同時認為應(yīng)該重視外治，《醫(yī)學源流》有“外科之法，最重外治”之說，糖尿病創(chuàng)面的中醫(yī)內(nèi)外治法結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學更符合臨床分型論治的實際需要。明?陳實功《外科正宗》認為發(fā)生在四肢的糖尿病創(chuàng)面是脫疽的一種，特點是外有足指筋肉潰腐同時內(nèi)有五臟機能衰??；治療時遵循的原則是盡快切除組織，并纏繞患指末節(jié)防止毒氣攻延擴散，使用蟾酥餅加艾灸加速局部腐肉枯干，減少切除后的并發(fā)癥。中醫(yī)認為糖尿病創(chuàng)面感染符合濕熱毒盛辨證，常用清熱利濕的中藥內(nèi)服外用控制感染[25-26]。現(xiàn)代臨床研究中也將外用中藥制劑與VSD等技術(shù)相結(jié)合用于控制糖尿病創(chuàng)面感染。

王寧等[27]使用復方黃柏液溻漬治療糖尿病足感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，試驗組和對照組各52例，總有效率分別為92%和77%。治療后，在創(chuàng)面面積縮小及中醫(yī)證候積分降低的對比上，試驗組均優(yōu)于對照組；表明復方黃柏液可以控制創(chuàng)面耐藥菌感染。劉佳蒞等[28]將生肌玉紅膏與VSD聯(lián)合使用治療糖尿病創(chuàng)面，選取70例糖尿病足潰瘍患者隨機分為兩組，每組35例。所有患者均給予常規(guī)清創(chuàng)處理及VSD，觀察組加用生肌玉紅膏聯(lián)合負壓引流術(shù)治療。觀察比較兩組患者治療后創(chuàng)面愈合時間、創(chuàng)面愈合率、踝肱指數(shù)變化情況；并評價創(chuàng)面血管內(nèi)皮生長因子、內(nèi)皮抑素表達情況及超氧化物歧化酶、丙二醛、晚期蛋白氧化產(chǎn)物等氧化應(yīng)激指標；治療后觀察組患者創(chuàng)面愈合時間縮短，創(chuàng)面愈合率及踝肱指數(shù)升高，差異均有統(tǒng)計學意義；觀察組創(chuàng)面血管內(nèi)皮生長因子表達的平均吸光度值高于對照組，創(chuàng)面內(nèi)皮抑素的水平明顯低于對照組；觀察組超氧化物歧化酶水平高于對照組，晚期蛋白氧化產(chǎn)物水平低于對照組；表明生肌玉紅膏可以通過降低氧化應(yīng)激減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng)，促進創(chuàng)面肉芽生長。

3.2 中醫(yī)藥治療糖尿病創(chuàng)面感染的實驗研究進展 中藥在治療糖尿病創(chuàng)面的巨大優(yōu)勢，研究中藥治療糖尿病創(chuàng)面的作用機制不僅可豐富中醫(yī)外治理論，同時為中醫(yī)藥治療糖尿病創(chuàng)面提供豐富的科學依據(jù)。外用單味藥及其有效成分以姜黃、黃連、雷公藤等常見，復方多以溻漬法消炎抗菌，通過調(diào)控不同通路促進糖尿病創(chuàng)面愈合[29-30]。

3.2.1 單味藥及有效成分控制糖尿病創(chuàng)面感染的實驗研究進展 現(xiàn)代研究表明糖尿病創(chuàng)面的特點是炎癥指標TNF-α升高和愈合指標TGF-β1降低[31]，研究發(fā)現(xiàn)一些外用中藥可以明顯地改善糖尿病創(chuàng)面炎癥以及控制感染，且能促進壞死組織脫落[32]，能這一現(xiàn)象可能與外用中藥某些成分直接作用于病原體、調(diào)控TLR受體通路與SOCS調(diào)控炎癥反應(yīng)有關(guān)。Zhang[33]等研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，使用db/db小鼠腹腔注射芍藥苷，結(jié)果表明芍藥苷可通過阻斷TLR2/4信號通路，降低尿白蛋白排泄率，抑制巨噬細胞浸潤和活化；體外實驗結(jié)果表明芍藥苷通過抑制TLR2/4降低了AGEs誘導RAW264.7細胞的活化和炎癥反應(yīng)。Shi等[34]研究發(fā)現(xiàn)炎癥與樹突狀細胞和Th17細胞中的IL-6/Stat3通路有關(guān)，芍藥苷已被臨床證明是治療炎癥性皮膚病的有效藥物；并已經(jīng)證明芍藥苷對1-氯-2，4-二硝基苯（DNCB）和幼稚CD4+CD45RA+T細胞刺激的樹突狀細胞有促進Th17細胞分化的作用；芍藥苷在基因和蛋白質(zhì)水平上均能降低DNCB刺激的樹突狀細胞中IL-6/Stat3通路表達；這表明芍藥苷通過減少Socs3的表達或使Socs3等負性調(diào)節(jié)因子失活產(chǎn)生抗炎效果，從而調(diào)控糖尿病創(chuàng)面創(chuàng)面炎癥并能減輕組織損傷程度。Zhao等[35]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素作為一種有效的抗菌抗炎藥，可以通過調(diào)節(jié)JAK/STAT/SOCS信號通路來抑制樹突狀細胞的活化；活化的樹突狀細胞可以促進糖尿病創(chuàng)面創(chuàng)面壞死組織的脫落[36]。朱水蘭等[37]發(fā)現(xiàn)黃芩苷可以明顯抑制炎癥通路中SOCS3的表達，并減弱下游炎癥效應(yīng)因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達；王欣之等[38]研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素(TP)在體外誘導SOCS-1和SOCS-3的mRNA表達；通過SOCS-1/3上調(diào)IL-2和IL-10抗炎分子的分泌。IL-10進一步調(diào)節(jié)T淋巴細胞免疫功能，促進糖尿病創(chuàng)面的愈合。石榴皮粗提物聯(lián)合乙酸乙酯及納米銀為主要原料，制備了用于慢性創(chuàng)面愈合的活性創(chuàng)面敷料水凝膠。對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）為63 μg/mL，對銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度為125 μg/mL；以大鼠為動物模型，通過組織病理學檢查證實了活性創(chuàng)面敷料對糖尿病創(chuàng)面的影響。此外，還能增強表皮細胞中轉(zhuǎn)化生長因子β和活化B細胞核因子kappa輕鏈增強劑的有效性[39]。

隨著醫(yī)用材料和制藥技術(shù)的發(fā)展，納米技術(shù)使得創(chuàng)面敷料具有大孔隙率、良好的吸濕性、良好的氧交換率等特性；從天然資源和合成資源中選擇合適的聚合物可以拓寬納米纖維的應(yīng)用范圍[40]。納米中藥復合材料可能具有更好的抗感染、抗炎性能，可進一步開發(fā)用于對抗威脅性超級細菌的抗菌抗感染劑。

3.2.2 復方藥治療糖尿病感染創(chuàng)面的實驗研究進展 中藥復方治療糖尿病感染創(chuàng)面多采用濕敷法，目前大多數(shù)研究表明炎癥反應(yīng)與TLR4和NF-κB關(guān)系密切[41-42]，中藥外用可能也是通過SOCS調(diào)控TLRs信號通路的強度，減少炎癥反應(yīng)帶來的損傷。徐陽[43]等將丹黃消炎液用于皮膚感染泛耐藥鮑曼不動桿菌的新西蘭兔潰瘍模型，發(fā)現(xiàn)用藥后48 h中藥灌胃組TLR-4為(0.1809±0.0357)，IL-1β為(2.0503±0.2632)，中藥外敷組TLR-4為(0.1824±0.0194)，IL-1β為(2.6405±0.5425)，表達均較空白組明顯升高，用藥后72 h中藥灌胃組和中藥外敷組TLR-4、IL-1β表達均較空白組明顯升高，且用藥48 h TLR-4、IL-1β達到峰值。用藥后10d空白組TLR-4、IL-1β表達明顯高于中藥灌胃組、中藥外敷組；用藥后72 h電鏡檢測顯示，中藥灌胃組、中藥外敷組細菌大量壞死粘連，中藥外敷組略優(yōu)于中藥灌胃組；表明TLR-4、IL-1β的表達升高參與機體的炎癥，中藥丹黃消炎液可以達到抗炎、抗感染的作用。

4 結(jié)語與展望

與正常創(chuàng)面相比，糖尿病創(chuàng)面愈合涉及更多的信號通路以及細胞因子。TLRs通路和SOCS蛋白在糖尿病創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮了重要作用，中醫(yī)藥基TLRs樣受體通路/SOCS蛋白對糖尿病創(chuàng)面等慢性創(chuàng)面進行了一定量的研究。上述通路著眼于糖尿病創(chuàng)面局部炎癥表達過度，導致免疫環(huán)境紊亂，腐肉難去創(chuàng)面難以愈合；通過中醫(yī)中藥調(diào)控局部炎癥，促進生長類因子釋放達到促進創(chuàng)面愈合的效果。中藥提取成分多用于研究對特定細胞SOCS1/3/4的影響，多為抗炎方面的研究，促愈研究相對較少；外用單味中藥的抗菌效果和機制研究不夠深入；臨床治療糖尿病創(chuàng)面常用解毒佐以扶正類藥物（如黃柏、黃芪）、活血化瘀藥（川芎、紅花）等中藥復方，這些復方在蛋白之間相互作用中的關(guān)鍵靶點研究較少。因此，精準深入地研究中醫(yī)藥現(xiàn)代劑型通過TLRs通路/SOCS蛋白促進糖尿病創(chuàng)面愈合機制尤為重要，可以為中醫(yī)藥治療慢性創(chuàng)面提供更多的依據(jù)。