膿毒血癥中的心臟自噬

葉冰潔，宋志

作者單位：1 518000 深圳,深圳市深圳大學(xué)總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科

膿毒血癥是全世界重癥監(jiān)護(hù)病房患者的主要死因[1]，表現(xiàn)為一種致命的器官功能障礙，由宿主對(duì)感染的反應(yīng)引起[2]。膿毒癥已成為一個(gè)主要的公共衛(wèi)生問題，患者常合并慢性并發(fā)癥，嚴(yán)重降低生活質(zhì)量并給社會(huì)及家庭造成嚴(yán)重影響和負(fù)擔(dān)。目前膿毒癥的治療仍是支持性治療，大多數(shù)基于分子的治療在臨床嘗試中都失敗了[3,4]。探索新的治療干預(yù)措施以促進(jìn)這種破壞性臨床疾病的治療，迫在眉睫。

心功能不全是膿毒癥引起多器官衰竭的一個(gè)嚴(yán)重組成部分，過度炎癥包括代謝和β-腎上腺素能反應(yīng)受損被認(rèn)為是潛在因素[5]，膿毒血癥引起心肌病的病理生理機(jī)制已成為研究的重點(diǎn)。線粒體約占心肌細(xì)胞體積的30%[6]。研究表明，膿毒血癥會(huì)導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，這種異常不僅使能量供應(yīng)不足，還會(huì)造成線粒體衍生的危險(xiǎn)信號(hào)分子（DAMPs）過度產(chǎn)生，如活性氧簇（mtROS）、線粒體DNA碎片（mtDNA）、N-甲酰肽、心磷脂、ATP、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A和細(xì)胞色素C。這些有害分子會(huì)加劇膿毒血癥期間的心肌炎癥，造成繼發(fā)性心肌病[7-9]。

最近研究揭示了自噬在胚胎發(fā)生、發(fā)育、細(xì)胞死亡和免疫中充當(dāng)新的角色，并且自噬功能障礙和疾病間的密切相關(guān)[10-12]。自噬對(duì)許多疾病有著雙重作用，其有助于細(xì)胞對(duì)代謝和炎癥的調(diào)節(jié)。在正常生理情況或輕度打擊下，自噬具有適應(yīng)性，促進(jìn)細(xì)胞存活；在嚴(yán)重和長期打擊下，引起過度自噬活動(dòng)和自噬不足，導(dǎo)致大量細(xì)胞質(zhì)自身降解和有毒物質(zhì)的積累，這些結(jié)果中的任何一種都是適應(yīng)不良的表現(xiàn)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究表明，膿毒血癥會(huì)引起包括心臟在內(nèi)的多個(gè)器官的自噬。自噬的調(diào)節(jié)可作為治療膿毒血癥的新策略。膿毒血癥相關(guān)的自噬增加是一種清除受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的溶酶體依賴過程。越來越多證據(jù)表明膿毒血癥可引發(fā)包括心臟在內(nèi)的多個(gè)器官的自噬[13-16]。

1 膿毒血癥期間自噬動(dòng)態(tài)變化

自噬控制細(xì)胞的質(zhì)量，促進(jìn)細(xì)胞存活，在生理反應(yīng)或輕度壓力下，它是適應(yīng)性的。但在嚴(yán)重或慢性打擊下，過度或不充分的自噬會(huì)導(dǎo)致大量的自我降解或有毒物質(zhì)積累；這兩者都是不適應(yīng)性的，最終致細(xì)胞死亡[17]。例如無論是小鼠的盲腸結(jié)扎穿刺（CLP）膿毒血癥在體模型還是脂多糖（LPS）培養(yǎng)的心肌細(xì)胞體外模型都表明，刺激自噬可以保護(hù)心肌，表明自噬對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，是一種適應(yīng)性反應(yīng)。相反，通過自噬抑制劑直接減少自噬，或通過抗氧化劑間接減少自噬，可改善脂多糖誘導(dǎo)的膿毒血癥小鼠的心肌收縮力，從而支持自噬適應(yīng)不良的結(jié)論[18]。這些觀察結(jié)果的差異可能是由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境、膿毒癥的嚴(yán)重程度、藥物特異性及給藥時(shí)間的不同造成。

最近一項(xiàng)研究表明，心臟自噬隨著膿毒血癥的嚴(yán)重程度發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。該研究檢測了LPS誘導(dǎo)膿毒血癥小鼠心臟組織自噬反應(yīng)的程度，發(fā)現(xiàn)LPS觸發(fā)了劑量依賴性自噬反應(yīng)[19]。當(dāng)?shù)蛣┝拷o予LPS時(shí)，模擬輕度膿毒血癥模型，自噬與損傷程度成比例增加。而在嚴(yán)重膿毒癥的情況下，這種能力與損傷的嚴(yán)重程度成比例下降。此外還發(fā)現(xiàn)，大劑量LPS誘導(dǎo)下的自噬失敗與mTOR信號(hào)的激活和臨床體征的出現(xiàn)有關(guān)，表現(xiàn)為心功能下降、炎癥指標(biāo)升高和心肌組織受損。這些心臟自噬的觀察結(jié)果與肝臟自噬報(bào)告一致，顯示在膿毒血癥的早期階段自噬增加，隨后在小鼠CLP膿毒血癥模型的晚期器官衰竭階段減少[20]。在輕度膿毒血癥或膿毒血癥的初期階段，自噬是適應(yīng)性的，促進(jìn)細(xì)胞生存、維持器官的正常功能。當(dāng)膿毒血癥進(jìn)展到嚴(yán)重情況時(shí)，自噬反應(yīng)變得不充分，導(dǎo)致自噬適應(yīng)不良。

mTOR通路是一個(gè)抑制自噬的經(jīng)典上游節(jié)點(diǎn)[21]。低劑量LPS組小鼠心臟的mTOR復(fù)合物激活狀態(tài)明顯降低。高劑量LPS引起的自噬減弱明顯與mTOR的激活有關(guān)[19]。結(jié)果表明，在膿毒血癥的嚴(yán)重階段，mTOR的激活抑制有益的自噬活動(dòng)。雖然mTOR長期以來被認(rèn)為是控制自噬活動(dòng)開啟和關(guān)閉的常規(guī)調(diào)節(jié)開關(guān)，但最近研究發(fā)現(xiàn)，許多自噬刺激通路的作用不涉及mTOR。這類信號(hào)包括細(xì)胞內(nèi)肌醇-IP3途徑、Ca2+-鈣質(zhì)途徑、通過cAMP（Epac）-PLCε-IP3途徑激活的cAMP交換蛋白、富含亮氨酸的重復(fù)激酶2和海藻糖等[22]。

2 Beclin-1依賴性自噬在膿毒血癥期間對(duì)心臟的保護(hù)

Beclin-1是最早發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物自噬效應(yīng)物之一。這種蛋白普遍表達(dá)，Beclin-1基因的純合子缺失導(dǎo)致早期胚胎死亡。Beclin-1通過與PtdIns(3)-激酶的相互作用發(fā)揮自噬起始因子的作用。這一蛋白復(fù)合物共同啟動(dòng)自噬的關(guān)鍵步驟，并參與自噬體與溶酶體融合的后續(xù)步驟[23]。

用心臟特異性Beclin-1過表達(dá)和雜合子缺乏的辦法來使轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的Beclin-1增加和減少。Beclin-1的過度表達(dá)減輕了心臟炎癥和纖維化損傷，保護(hù)了線粒體，最終改善了脂多糖對(duì)心臟的損害。在高劑量的LPS刺激下，Beclin-1的過度表達(dá)使心臟中mTOR的激活減弱[19]。由于mTOR的激活與自噬活性呈負(fù)相關(guān)，因此，即使在嚴(yán)重膿毒血癥的情況下，增強(qiáng)beclin-1信號(hào)可以抑制mTOR的激活，維持自噬。同時(shí)還觀察到，AMP激活蛋白激酶（AMPK）和UNC-51樣自噬激活激酶1（ULK1）的Beclin-1依賴性激活。研究者普遍認(rèn)為，mTOR通過抑制ULK1（一種在beclin-1上游起作用的自噬激活激酶）來抑制自噬[24]。上述研究表明在對(duì)抗膿毒血癥中，Beclin-1可能通過增強(qiáng)心臟中AMPK和ULK1的表達(dá)來參與自噬的正反饋調(diào)節(jié)。

在小鼠CLP膿毒血癥模型中，一氧化碳治療的研究也提示了Beclin-1介導(dǎo)的膿毒血癥保護(hù)作用[25]。敲除Beclin-1可消除CO減輕炎癥的有益作用。Beclin-1也是巨噬細(xì)胞增強(qiáng)吞噬功能所必需的，因此，Beclin-1對(duì)膿毒血癥的保護(hù)并不局限于心臟。然而，在膿毒血癥的病理?xiàng)l件下，Beclin-1在各種細(xì)胞和組織中的調(diào)節(jié)作用仍有待進(jìn)一步研究。

3 Beclin-1對(duì)心肌線粒體的依賴性保護(hù)作用

膿毒血癥引起線粒體損傷，加重心肌炎癥和心臟功能障礙程度[26]。膿毒血癥時(shí)，脂多糖會(huì)破壞線粒體結(jié)構(gòu)，損害代謝功能，并將mtDNA片段釋放到心臟組織的細(xì)胞液中。LPS激發(fā)后線粒體損傷的這些表現(xiàn)，在具有Beclin-1過度表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠心臟中被減弱，表明Beclin-1在膿毒血癥中對(duì)心肌線粒體的保護(hù)具有關(guān)鍵作用[19]。

功能失調(diào)的線粒體可通過自噬得以恢復(fù)[27]。事實(shí)上，Beclin-1的過度表達(dá)導(dǎo)致心臟組織中更多的線粒體/溶酶體形成，Beclin-1介導(dǎo)的膿毒血癥期間心臟線粒體的質(zhì)量控制有望成為上調(diào)線粒體自噬的產(chǎn)物[19]。一種途徑受PTEN誘導(dǎo)的假定激酶1（PINK1）和E3泛素連接酶Parkin調(diào)節(jié)，后者以膜電位丟失的線粒體為靶點(diǎn)，隨后將這些線粒體帶到自噬體進(jìn)行降解[28]?；蛘?，線粒體自噬通過外部線粒體膜（OMM）定位的受體（如BNIP3L/NIX，BNIP3和FUNDC1）啟動(dòng)，這些受體將線粒體與自噬體聯(lián)系起來[29]。并非所有線粒體自噬都是相同的，激活線粒體自噬的信號(hào)分子有選擇地響應(yīng)不同刺激。在應(yīng)對(duì)LPS時(shí)，Beclin-1刺激線粒體自噬，PINK1和Parkin選擇性地向線粒體聚集，同時(shí)強(qiáng)烈抑制受體蛋白BNIP3L和BNIP3。這些數(shù)據(jù)表明Beclin-1通過選擇性激活特定的線粒體自噬途徑來保護(hù)線粒體，而不是大量誘導(dǎo)所有類型的線粒體自噬。該研究還支持PINK1-Parkin線粒體自噬在膿毒血癥期間具有心臟保護(hù)作用，是一種適應(yīng)性反應(yīng)[30]。

Beclin-1是否和如何通過PINK1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來進(jìn)行線粒體自噬尚不完全清楚。幾項(xiàng)研究表明，PINK1通過磷酸化的線粒體融合蛋白2（Mfn2）將Parkin聚集到受損的線粒體中。在上述膿毒血癥的動(dòng)物模型中，使用western blotting技術(shù)，在Beclin-1過度表達(dá)的小鼠心臟組織中未檢測到Parkin或Mfn2磷酸化。值得注意的是，在蛋白靶點(diǎn)過度表達(dá)的細(xì)胞中檢測到磷酸化的Parkin或Mfn2[31]。目前的方法在檢測體內(nèi)磷酸化PINK1、Parkin和MFN2的生理表達(dá)含量方面可能有局限性。推測Beclin-1激活的PINK1-Parkin線粒體自噬的刺激可能涉及線粒體相關(guān)膜（MAMs）。MAMs是一種特殊的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)域，它將線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）連接起來，對(duì)線粒體至關(guān)重要[32]。Beclin-1被發(fā)現(xiàn)與Parkin相互作用，這種聯(lián)系對(duì)于PINK1-Parkin線粒體自噬的進(jìn)展是必需的[33]。因此，當(dāng)Beclin-1信號(hào)上調(diào)時(shí)，PINK1-Parkin線粒體自噬途徑更易被激活。

除了通過線粒體自噬去除受損線粒體外，Beclin-1還可通過上調(diào)PINK1/parkin和/或AMPK/ULK1來促進(jìn)線粒體的生物發(fā)生[34]。最近研究表明，Parkin可通過蛋白酶體降解底物PARIS（一種鋅指蛋白）高效調(diào)節(jié)線粒體的生物發(fā)生[35]。迄今為止，是否利用類似的機(jī)制來調(diào)節(jié)膿毒血癥心臟的線粒體仍有待進(jìn)一步研究。

Beclin-1抑制BNIP3信號(hào)的機(jī)制有待確定。與PINK1-Parkin的功能相似，BNIP3在線粒體中也起著雙重調(diào)節(jié)作用。通過缺氧誘導(dǎo)因子1和FOXO3a和/或通過ROS的翻譯后氧化來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[36]。激活時(shí)，BNIP3促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）的開放，聚集LC3形成自噬體，并啟動(dòng)線粒體自噬[37]。這種蛋白會(huì)導(dǎo)致線粒體功能障礙，隨后在應(yīng)激條件下通過激活下游效應(yīng)器Bax/Bak誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[38]。在心肌中既能觀察到BINP3誘導(dǎo)的自噬，又能觀察到線粒體損傷[39]。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3a轉(zhuǎn)錄上調(diào)的BNIP3使得線粒體膜電位降低，線粒體Ca2+增加，導(dǎo)致線粒體斷裂和心肌細(xì)胞凋亡[36]。因此，BNIP3的積累對(duì)線粒體的影響是其雙重作用平衡的結(jié)果。在脂多糖干預(yù)小鼠的心臟中，線粒體BNIP3的增加可能加重有害的線粒體缺乏，而誘導(dǎo)的自噬又不足以清除受損的線粒體，Beclin-1可能具有削弱BNIP3信號(hào)的控制作用[19]。BNIP3信號(hào)在缺氧和缺血/再灌注條件下產(chǎn)生病理反應(yīng)，然而，BNIP3在膿毒血癥引起的心臟功能障礙中是否具有病理性以及Beclin-1如何與BNIP3相互作用需要進(jìn)一步研究。雖然Beclin-1選擇性地促進(jìn)PINK1-Parkin線粒體自噬以清除受損的線粒體，但Beclin-1也通過PINK1/Parkin以及AMPK/ULK1促進(jìn)線粒體生物發(fā)生。當(dāng)Beclin-1信號(hào)增強(qiáng)時(shí)，這些效應(yīng)共同作用，維持膿毒血癥期間線粒體的功能。相反，在膿毒血癥的打擊下，當(dāng)Beclin-1的信號(hào)不充分時(shí)，更強(qiáng)的線粒體BNIP3信號(hào)和AMPK、ULK1的低水平激活以及強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)加劇心臟線粒體的惡化。

4 膿毒癥期間心臟功能障礙的線粒體自噬和炎癥

自噬通過限制炎癥激活物和通過線粒體自噬來減少線粒體DAMPs控制炎癥。另一方面，在某些嚴(yán)重或長期打擊下，自噬的增加可能會(huì)加劇由于細(xì)胞成分不受管制的降解而形成不必要的結(jié)果，導(dǎo)致毀滅性炎癥[40]。線粒體和線粒體自噬對(duì)炎癥調(diào)節(jié)的影響近年來受到了廣泛關(guān)注。我們發(fā)現(xiàn)胞漿mtDNA與細(xì)胞內(nèi)TLR9結(jié)合并激活炎癥因子NF-κB，也刺激了DNA傳感器cGAS，促進(jìn)了STING-IRF3依賴性途徑[41]。線粒體自噬被認(rèn)為是消除線粒體功能紊亂，減少線粒體DAMPs（如mtDNA）的有效途徑。

先前研究表明，膿毒血癥和創(chuàng)傷性的心臟炎癥，至少是由toll樣受體4（TLR4）/CD14復(fù)合物的激活和線粒體DAMPs的增加介導(dǎo)的。在脂多糖誘導(dǎo)的膿毒血癥模型中，增加Beclin-1依賴性自噬可改善心臟預(yù)后并減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生[20]。然而，這種益處也有一定局限性，對(duì)于高劑量LPS（10 mg/kg）的反應(yīng)，即使自噬活性被顯著提高了，Beclin-1過度表達(dá)的小鼠仍會(huì)發(fā)生毀滅性炎癥反應(yīng)。炎癥仍是小鼠心臟功能障礙的一個(gè)主要原因。此外，不能排除自噬增加本身可能導(dǎo)致心力衰竭的可能性。自噬和炎癥間的信號(hào)交叉在各種疾病發(fā)展過程中動(dòng)態(tài)演變[40]。

5 基于自噬的膿毒癥治療機(jī)會(huì)

目前以自噬為基礎(chǔ)的治療方法尚未用于臨床。盡管某些經(jīng)FDA批準(zhǔn)的藥物，如雷帕霉素、氯喹和二甲雙胍具有激活或停止自噬的作用，但它們并不是為了調(diào)節(jié)自噬而研發(fā)的，并且這些藥物在體內(nèi)具有廣譜的影響。例如，雷帕霉素是mTOR（一種負(fù)性調(diào)節(jié)自噬的絲氨酸/蘇氨酸激酶）的抑制劑。mTOR也參與了自噬以外的功能，如蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、新陳代謝、能量平衡和應(yīng)激反應(yīng)[42]。迄今為止，膿毒血癥如何引發(fā)自噬反應(yīng)的途徑還不清楚。未來這一領(lǐng)域的研究成功將大大促進(jìn)新的藥理學(xué)干預(yù)措施的發(fā)展，特別是針對(duì)自噬因子，這可能成為一個(gè)大大的對(duì)抗膿毒血癥的好方法。

近年來，新出現(xiàn)的藥物研發(fā)工作已與自噬機(jī)制的調(diào)節(jié)因素脫節(jié)。自噬誘導(dǎo)療法的一個(gè)重大進(jìn)展是發(fā)現(xiàn)了一種細(xì)胞通透性Beclin-1激活肽，即Tat-Beclin-1肽（TB肽）。TB肽含有Beclin-1的BARA結(jié)構(gòu)域的18個(gè)氨基酸，通過競爭性地將內(nèi)源性Beclin-1結(jié)合到其負(fù)調(diào)節(jié)因子高爾基體相關(guān)植物致病相關(guān)蛋白1來誘導(dǎo)自噬，這種肽在與減少病毒感染中顯示出治療益處，在壓力超負(fù)荷時(shí)改善心臟功能，并增強(qiáng)化療的有效性[43]。研究還發(fā)現(xiàn)了三種具有自噬誘導(dǎo)物特征的新型小分子，這些分子阻斷了beclin-1與其下游抑制劑Bcl2的結(jié)合，從而刺激自噬[44]。

給予LPS誘導(dǎo)的膿毒血癥小鼠結(jié)核肽，能顯著改善小鼠心功能，減少循環(huán)細(xì)胞因子，尤其是TNF-α、IFN-γ、IL-17α和IL-6。作用機(jī)制是通過直接靶向刺激Beclin-1介導(dǎo)的，為評(píng)估該藥物在膿毒血癥中的治療潛力提供重要依據(jù)。

6 總結(jié)

自噬在膿毒血癥引起的器官功能障礙的病理過程中起著重要作用。多項(xiàng)表明，自噬在膿毒血癥的進(jìn)展過程中發(fā)生著動(dòng)態(tài)變化，膿毒血癥后期自噬不足且適應(yīng)不良。這種缺陷與mTOR信號(hào)的上調(diào)有關(guān)，細(xì)胞內(nèi)去除功能失調(diào)的細(xì)胞器和有毒物質(zhì)導(dǎo)致大量的DAMPs積聚。特異性靶向自噬因子為膿毒血癥的治療提供了一個(gè)新的機(jī)會(huì)。