核酸適配體在肺腺癌診斷和治療中的應(yīng)用現(xiàn)狀及研究進(jìn)展

李名一，姜良勇，高 川，劉媛媛

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科，黑龍江 佳木斯 154004；2.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

20世紀(jì)末，單克隆抗體(mAb)技術(shù)的出現(xiàn)給醫(yī)學(xué)攻克癌癥帶來了希望。但是它并沒有達(dá)到預(yù)期效果，之后隨及出現(xiàn)了一種使生物分子特異性結(jié)合的技術(shù)，它就是我們現(xiàn)在所熟知的適配體，aptamer(適配體)來源于拉丁語“aptus”，意思是“西服”，希臘語后綴“meros”意為“部分”，這說明適配體具有與特定目標(biāo)進(jìn)行互動(dòng)的潛力。是最早由Ellington等[1]和Tuerk等在1990年提出，核酸適配體是從一種人工合成的寡核苷酸文庫(kù)中篩選得到單鏈寡核苷酸， 可以是單鏈 DNA， 也可以是RNA[2]。分子量約為10 ～ 30 kDa，明顯小于抗體。DNA相對(duì)而言，它在體外會(huì)更穩(wěn)定?？梢酝ㄟ^三維互補(bǔ)，不是堿基配對(duì)，來識(shí)別目標(biāo)，并與目標(biāo)結(jié)合，特異性和親和力高，有或幾乎沒有免疫原性，不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)[3]。同樣它們也被叫做"核酸抗體"。迄今為止，適配體已經(jīng)應(yīng)用于很多的生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，從生物成像、疾病診斷、靶向治療以及給藥。它們?cè)谂R床和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中顯示出非常大的潛力。它是一種短小的單鏈寡核苷酸，可以折疊成獨(dú)特的3D結(jié)構(gòu)。適配體，它是通過一種被稱為"指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化"(SELEX)技術(shù)篩選出來的。這種Cell-SELEX技術(shù)篩選的靶標(biāo)有癌細(xì)胞，正常細(xì)胞和炎癥細(xì)胞等，器官和組織也有很多，有腦、肺、肝、胰腺、乳腺和卵巢等。其中SELEX主要包括毛細(xì)管電泳-SELEX (CE-SELEX)、細(xì)胞SELEX、快速SELEX。Cell-SELEX的主要優(yōu)勢(shì)在于，與以前的SELEX技術(shù)相比，Cell-SELEX的選擇過程可以在不需要靶蛋白基礎(chǔ)上進(jìn)行。但是Cell-SELEX也有一些缺點(diǎn)，比如它需要更多的篩選時(shí)間，對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的任何損傷都會(huì)影響篩選結(jié)果。適配體的優(yōu)點(diǎn)：(1)它具有非常廣泛的靶標(biāo)范圍；(2)適配體制備時(shí)間較短，它是在體外制備，從而避免了長(zhǎng)時(shí)間免疫；(3)適配體易于修飾，有較高的穩(wěn)定性；(4)適配體的批與批之間的變化較少；(5)適配體的制備成本比單克隆抗體低；(6)高組織滲透率(由于它們的小尺寸)，脫水形式的穩(wěn)定性高，易于化學(xué)合成；(7)適配體可長(zhǎng)期保存；(8)適配體對(duì)溫度不敏感，可耐受80℃，而單克隆抗體則變性；(9)適配體分子量較小，治療時(shí)很容易穿透腫瘤等組織。此外，適配體還具有靶點(diǎn)廣泛、有高特異性、高親和力、低免疫原性、納米尺寸(直徑約1 ～ 2nm)等諸多優(yōu)點(diǎn)。

1 核酸適配體用于肺腺癌早期診斷和治療的現(xiàn)狀

肺癌仍然是我國(guó)死亡率的榜首，它嚴(yán)重的危害了人類的健康。肺癌有兩種組織學(xué)類型：非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)，非小細(xì)胞肺癌占肺癌病例的80%以上。疾病的分期影響非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后，5年生存率低[4]。其中非小細(xì)胞肺癌可以分為三個(gè)亞型：腺癌、鱗癌和大細(xì)胞肺癌。盡管肺癌的篩查、診斷和治療取得了很大的進(jìn)展，但是有約70%的患者在目前的醫(yī)療環(huán)境下很難被診斷出來，導(dǎo)致肺癌預(yù)后不良。因此，早期診斷與治療是提高肺癌患者生存率的關(guān)鍵。然而，目前大多數(shù)的肺癌診斷方法，如X射線、螺旋CT、MRI、PET/CT、纖維支氣管鏡檢查、縱隔鏡檢查，光學(xué)相干斷層掃描、正電子發(fā)射斷層掃描[5]，都是基于形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的，但是這些標(biāo)準(zhǔn)對(duì)早期發(fā)現(xiàn)不敏感，對(duì)癌癥也不特異。因此，非小細(xì)胞肺癌的早期診斷和治療越來越依賴于分子探針的開發(fā)，這些探針可以識(shí)別肺癌發(fā)生發(fā)展中的異常，并使臨床醫(yī)生能夠識(shí)別不同的亞型。尋找更多臨床上有效的肺癌生物標(biāo)志物以及肺癌診斷仍是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。適配子作為一類用于疾病診斷和治療的新型分子探針引起了人們的極大關(guān)注。目前為止，已經(jīng)用這種方法篩選出了針對(duì)白血病細(xì)胞、肝細(xì)胞和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的適配子。最常見的腫瘤標(biāo)記物主要包括神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)[6]、前列腺特異抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、細(xì)胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、CA25、CA53、CA199,然而傳統(tǒng)的肺癌診斷技術(shù)靈敏度特別低，不能發(fā)現(xiàn)早期肺癌患者，因此核酸適配子代替抗體用于臨床檢測(cè)和治療已經(jīng)成為大勢(shì)所趨。

研究發(fā)現(xiàn)，一種新型的Gal-1靶向DNA適配子(AP-74M-545)，通過恢復(fù)免疫功能來證明該適配子的抗腫瘤作用，AP-74M-545與Gal-1高親和力結(jié)合。數(shù)據(jù)表明，Gal-1適配子通過阻斷Gal-1和CD45之間的相互作用而抑制腫瘤生長(zhǎng)，從而從凋亡中拯救T細(xì)胞，恢復(fù)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。這些結(jié)果表明AP-74M-545可能是一種潛在的腫瘤免疫治療策略。Kun Li等人首次以肺癌患者血清為靶點(diǎn)，在肺癌患者血清中篩選出6種與腫瘤標(biāo)志物具有特異性親和力的DNA適配子，為肺癌的早期診斷提供了一種新的高效、準(zhǔn)確的方法。研究通過消減SELEX技術(shù)篩選與肺癌患者血清有較強(qiáng)親和力的特異性核酸適配子，將羧化瓊脂小球在不同篩選參數(shù)下與肺癌患者血清蛋白結(jié)合，最終獲得6種特異性核酸適配子。為了去除靶分子，例如非靶物種的核酸適配子，首先進(jìn)行陰性篩選。隨后，將回收的上清液和磁珠與肺癌患者血清一起孵育進(jìn)行陽性篩選，然后在95℃下處理，獲得肺癌患者血清的特異性ssDNA文庫(kù)。獲得的ssDNA文庫(kù)通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)擴(kuò)增，然后結(jié)合鏈霉親和素-親和素小球制備二級(jí)ssDNA文庫(kù)，為下一步適配子的篩選做準(zhǔn)備。最后，通過第二代基因高通量測(cè)序分析來確定富集的適體序列和特異結(jié)合靶分子的適體序列的富集含量。結(jié)果顯示所獲得的6個(gè)適配子對(duì)肺癌患者血清具有特異性親和力，而對(duì)健康人血清沒有特異性親和力，表明所獲得的適配子對(duì)肺癌患者血清具有較高的特異性親和力。

2 核酸適配體偶聯(lián)藥物在肺腺癌治療中的應(yīng)用現(xiàn)狀

表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)厄洛替尼在肺癌治療中具有良好的療效。不幸的是，攜帶TKI耐藥EGFR突變的個(gè)體通常會(huì)對(duì)厄洛替尼產(chǎn)生獲得性耐藥性。為了克服這種耐藥性，有研究者開發(fā)了以抗表皮生長(zhǎng)因子適體(APT)結(jié)合殼聚糖(APT-Cs)為穩(wěn)定載體的脂質(zhì)體，脂質(zhì)體因其固有的生物相容性和生物降解性而被認(rèn)為是一種很有前途的藥物載體，具有親水核和疏水殼的雙層納米材料，可以包裹水溶性較差的厄洛替尼[7]。將厄洛替尼輸送到靶部位，將厄洛替尼負(fù)載到apt-Cs錨定的脂質(zhì)體復(fù)合物(apt-CL-E)中，并表征了apt-CL-E的理化性質(zhì)，該納米粒表現(xiàn)出良好的生物穩(wěn)定性和對(duì)APT引導(dǎo)的EGFR突變的癌細(xì)胞的結(jié)合特異性。這種特異性結(jié)合促進(jìn)了apt-CL-E在EGFR突變的癌細(xì)胞中的攝取。細(xì)胞毒性研究表明，APT-CL-E在將厄洛替尼輸送到EGFR突變的癌細(xì)胞中，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和凋亡方面比其非靶向脂質(zhì)體具有優(yōu)勢(shì)。

腫瘤疾病化療也會(huì)發(fā)生耐藥性，所以通過內(nèi)吞作用選擇性靶向給藥，可以減少藥物劑量和不良反應(yīng)，同時(shí)也能最大限度地提高治療效果。德國(guó)學(xué)者開發(fā)了一種疏水性化療藥物(如紫杉醇，PTX)的靶向給藥平臺(tái)，其基礎(chǔ)是聚乙二醇(PEG)與聚己內(nèi)酯(PCL)形成PEG-PCL膠束，并以APTS為靶向基團(tuán)。這些APT-NPs選擇性地將PTX靶向NSCLC A549細(xì)胞模型，并有效地清除了它們，同時(shí)避免了對(duì)正常人其他器官的的毒性作用。結(jié)論研制了一種生物相容性嵌段共聚物PEG-PCL膠束包埋疏水性化療藥物PTX的給藥系統(tǒng)。研究了核酸適體修飾的納米粒子在藥物穩(wěn)定和腫瘤靶向方面的雙重作用，確定了納米粒子上最佳的適配體的濃度，負(fù)載PTX的APT(30)-NPs的尺寸約為15 nm(即在用于癌細(xì)胞靶向的理想尺寸范圍內(nèi)：10-50 nm)。這一顯著的治療窗口可以促進(jìn)最小劑量藥物的給藥，同時(shí)提高化療藥物治療的療效，減少副作用，并降低治療成本。

3 核酸適配體在肺腺癌應(yīng)用中面臨的問題及解決方法

由于我們目前對(duì)于疾病的診斷仍然不夠準(zhǔn)確，核酸適配體，它作為一種新型的分子探針[8]，將提供了一種全新的方法，從而對(duì)疾病進(jìn)行診斷和靶向治療。"適配子"它們是在體外從隨機(jī)序列池中挑選出來的。與以前的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物檢查相比，腫瘤標(biāo)志物篩選出的核酸適配體具有很高的特異性，加上影像學(xué)檢查結(jié)果，能夠使肺腺癌早期診斷更加準(zhǔn)確。核酸適配體有很多優(yōu)勢(shì)，還能進(jìn)行適配體-藥物偶聯(lián)，作用于某個(gè)靶點(diǎn)，起到靶向治療的作用，從而降低化學(xué)藥物的毒性作用。同時(shí)一些適配體還可以被開發(fā)成生物傳感器。但是核酸適配體是一把雙刃劍，它還存在著一些問題：(1)它的穩(wěn)定性較差，從體外篩選得到的適配體在體內(nèi)容易被核酸酶降解[9]；(2)適配體，體積小(約20kDa)，它可以迅速地從循環(huán)中清除，因此表現(xiàn)出較差的藥動(dòng)學(xué)和治療潛力。對(duì)于這些缺點(diǎn)，可以從以下幾個(gè)方面來解決上述問題(1)通過一些化學(xué)修飾，可以提高核酸適配體的核酸酶抗性；(2)篩選具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的適配體，如G-四聚體可以提高核酸適配體的穩(wěn)定性；(3) 解決核酸適配體易被腎臟過濾清除的問題，與大分子生物偶聯(lián)，比如偶聯(lián)一些納米材料。上述方法均可提高核酸適配體在體內(nèi)應(yīng)用的有效性，隨著研究的深入，核酸適配體現(xiàn)如今應(yīng)用于肺腺癌早期診斷和靶向治療，給腫瘤的診斷和治療注入了新的生機(jī)。；雖然不同癌細(xì)胞系的許多適配子都在開發(fā)，但是當(dāng)前廣泛應(yīng)用的適配體的種類仍然非常有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們的實(shí)際需求，因此研發(fā)更多的核酸適配體用于癌癥的診斷與治療，將會(huì)使更多患者得到更好的治療。