EAPⅡ與癌癥發(fā)生和發(fā)展的研究進展

癌癥的形成是一個多因素作用、多基因參與、多階段逐漸形成的復雜演進過程，其發(fā)生涉及到很多方面，包括基因的突變、細胞因子的表達變化以及信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)節(jié)等[1]。EAP Ⅱ（ETS1-Associated Protein Ⅱ）參與多種信號轉(zhuǎn)導途徑，例如TNF-TNFr，TGF-β 和MAPK，EAP Ⅱ與免疫防御，炎癥反應，病毒感染和 DNA 毒素（化學或放射療法）有相互作用。近年來研究發(fā)現(xiàn) EAP Ⅱ可上調(diào)致癌蛋白MYC 和cyclin D1 的表達，從而促進癌癥的發(fā)生和發(fā)展[2]。本研究就致癌因子 EAP Ⅱ在癌癥發(fā)生和發(fā)展中的作用機制作一綜述。

1 EAPⅡ概述

EAPⅡ為一種 ETS1 相關蛋白，是參與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)錄因子[3，4]，具有調(diào)節(jié)ETS1[5]的轉(zhuǎn)錄活性的作用。EAPⅡ也被確定為TTRAP（TRAF and TNF receptor-associated protein），即TRAF 和TNF 受體相關蛋白[6]。TTRAP 通過與CD40 的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）受體75 和TNF 受體相關因子（TNF receptor-associated factors，TRAFs）結(jié)合，抑制NF-κB 活化[7]。近年來，EAP Ⅱ被認為是第一個去除拓撲異構(gòu)酶介導的 5'-磷酸酪氨酰鍵上加合物的酶，稱為TDP2（tyrosyl-DNA phosphodiesterase 2，酪氨酰-DNA 磷酸二酯酶2）[8]。TDP2可在雙鏈斷裂時恢復 5'-磷酸末端，在酵母中對拓撲異構(gòu)酶 （ITop1）抑制劑喜樹堿產(chǎn)生抗性的TDP2 的連接和過表達做準備[9]。目前的研究主要闡述了EAP Ⅱ在許多生物過程中的生理和病理作用，包括胚胎發(fā)育、神經(jīng)元發(fā)育，癌癥發(fā)展、進展和化學抗藥性[10]。

2 EAPⅡ蛋白的結(jié)構(gòu)和功能

EAP Ⅱ基因在黑猩猩、狗、牛、小鼠、大鼠、雞、斑馬魚、軟體動物和秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中是保守的[11]。在人類中，EAP Ⅱ細胞遺傳帶位于6p22.3-p22.1[12]。七個EAP Ⅱ外顯子分布在17 kb 基因組 DNA的反鏈上。在大多數(shù)檢查的組織和細胞系中 EAP Ⅱ 基因的單個2.3 kb 轉(zhuǎn)錄子普遍表達，包括正常的人腎、肺、肝、胸腺、乳腺、卵巢和前列腺。EAP Ⅱ mRNA 編碼362個氨基酸的蛋白質(zhì)，以49kD 的表觀分子量遷移。該蛋白質(zhì)在大多數(shù)檢查過的癌細胞系中均可檢測到，EAP Ⅱ蛋白以43kD 遷移的一種變體形式也出現(xiàn)在許多癌細胞系中[13]。外源EAP Ⅱ的強制表達可產(chǎn)生兩條以49kD 和43kD 遷移的條帶。兩種形式都可以被多種EAP Ⅱ抗體特異性識別，并且可以被針對EAP Ⅱ轉(zhuǎn)錄本的編碼序列或非翻譯區(qū)（UTR）的各種shRNA 擊中。43kD 的EAP Ⅱ蛋白存在于哺乳動物細胞中。通過對EAP Ⅱ的蛋白質(zhì)序列比對，EAP Ⅱ包含一個保守域，保留了所有六個基序，這些基序是核酸內(nèi)切酶/核酸外切酶/磷酸酶超家族的標志[14]，這個龐大的蛋白質(zhì)家族包括參與細胞內(nèi)信號傳導的鎂依賴性核酸內(nèi)切酶和磷酸酶（Exo_endo_phos）。在 Exo_endo_phos家族中，EAP Ⅱ與人類HAP1、REF-1、APE1 最相似，它是一種核酸內(nèi)切酶，在DNA 修復過程中參與識別和切割嘌呤、嘧啶（AP）位點[15]。

3 EAPⅡ與相關信號傳導通路

EAPⅡ被證實可通過CD40、TNFR-75 和TRAFs5等適配激活，參與多個信號傳導通路并激活ETS1、ETS2 等因子[16]。到目前為止，已鑒定出20 多種與EAP Ⅱ相關的蛋白質(zhì)。EAP Ⅱ相關蛋白網(wǎng)絡主要牽涉兩種生物學功能：轉(zhuǎn)錄調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導。EAP Ⅱ的主要配型包括Ets家族成員在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子ETS1、ETS2、FLI1、Smad3[17]。Ets家族參與調(diào)控一些重要的生理或病理過程，包括細胞增殖、分化、淋巴細胞發(fā)育、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移[18]。Smad3是一種受體調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，可轉(zhuǎn)導由TGFβ 激活的細胞外信號[19]。而TGFβ是一種多功能細胞因子，參與調(diào)節(jié)上皮細胞的存活/或凋亡、增殖、分化和上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化[20]。EAP Ⅱ通過直接的蛋白結(jié)合抑制ETS1、Smad3 的反式激活[21]。EAP Ⅱ與Smad3的相互作用，可抑制斑馬魚胚胎發(fā)育中Snail1a 的表達而導致鈣黏蛋白的抑制[22]。因此，EAP Ⅱ本身沒有內(nèi)在的轉(zhuǎn)錄活性，與Gal4DNA 結(jié)合域融合的EAP Ⅱ（GAL4-DBD-EAP Ⅱ）不會激活Gal4。但是EAP Ⅱ可以正調(diào)控或負調(diào)控其他轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性。此外，EAP Ⅱ還可能通過調(diào)節(jié)信號級聯(lián)反應的上游來調(diào)節(jié)NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性，對AP-1 反式激活有類似抑制作用。因為ETS1 與AP-1或NF-κB 的相互作用廣泛參與了組合轉(zhuǎn)錄的控制，抑制的機制可能是通過干擾ETS1 的轉(zhuǎn)錄活性而實現(xiàn)的[23]。另一方面，EAP Ⅱ關聯(lián)所需的CD40 胞質(zhì)域（230-245aa）與TRAFs 識別基序重疊。CD40配體處理可顯著增加EAP Ⅱ-CD40 受體的結(jié)合，而EAP Ⅱ的過表達可抑制受體啟動的NF-κB 反式激活。但對p65或IKKα 誘導的反式激活沒有影響，表明EAP Ⅱ作用于信號級聯(lián)反應的上游成分[24]。腫瘤壞死因子受體相關因子（tumour necrosis factor receptor-associated factors，TRAFs）是NF-κB信號通路中的關鍵調(diào)節(jié)蛋白。TRAFs 涉及細胞活化、分化，細胞存活和免疫反應，在這些信號傳導途徑之間的交叉效應中發(fā)揮重要作用[25]。而EAP Ⅱ與TRAFs 有相關性，對TRAF6 的親和力最大[26]，提示EAP Ⅱ參與復雜的信號調(diào)節(jié)。Li 等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，EAP Ⅱ參與肺癌細胞中MAPK-ERK 信號傳導通路的調(diào)節(jié)。EAP Ⅱ過表達顯著激活Raf-1 和ERK1/2，但并不激活JNK 和p38 傳導通路。隨后通過信號傳導通路調(diào)節(jié)下游靶標MYC 和cyclinD1。這些結(jié)果表明，EAP Ⅱ通過解除EGFR 信號傳導來促進肺癌的發(fā)展，這與NSCLC 的發(fā)展和進程有關[27]。Zucchelli 等[28]的研究顯示，在神經(jīng)母細胞瘤細胞中，EAP Ⅱ在野生型DJ-1 存在下會抑制JNK 活性。然而，與EAP Ⅱ強烈結(jié)合的突變體DJ-1 通過JNK 和p38MAPK 途徑誘導了細胞死亡。因此，EAP Ⅱ可能充當打開或關閉特定信號通路的開關角色。

4 EAPⅡ與癌癥

4.1 參與凋亡誘導的調(diào)節(jié)眾所周知，回避細胞凋亡是癌癥發(fā)展的特征之一。研究EAP Ⅱ在細胞凋亡中的作用有利于探索癌癥的發(fā)展中EAP Ⅱ的作用機制。近幾年的研究顯示EAP Ⅱ可以細胞特異性方式保護細胞免于凋亡或促進細胞凋亡。有趣的是，不同研究中的癌癥模型顯示EAP Ⅱ的實驗結(jié)果卻大相徑庭。EAP Ⅱ?qū)毎蛲鲇幸种谱饔茫鏩ucchelli 等[28]報道了EAP Ⅱ保護神經(jīng)母細胞瘤細胞免受蛋白酶體抑制劑MG132 誘導凋亡的實驗結(jié)果。Li 等[13]研究中指出EAP Ⅱ受抑制可導致H460、H522 和H1975型肺癌細胞凋亡。另一方面，EAP Ⅱ在一些細胞系中卻促進細胞凋亡作用。EAP Ⅱ可促進細胞毒性劑氫醌誘導的HL-60細胞凋亡[29]。Cao 等[30]指出癌基因與Ras 結(jié)合依賴于EAP Ⅱ的調(diào)控，通過JNK 和p38MAPK 信號通路從而促進細胞凋亡。此外，由FOXO3a 激活依賴于JNK 傳導通路的TNF 受體信號，所引起的細胞凋亡過程中，EAP Ⅱ表達顯著上調(diào)[31]。EAP Ⅱ?qū)毎蛲龅恼{(diào)控作用可能是由于EAP Ⅱ激活與之相互作用的蛋白以及相關的信號傳導途徑引起的。如TNF 和TGF-β，涉及促凋亡和（或）抗凋亡發(fā)生。這些過程涉及促凋亡和（或）抗凋亡，具體取決于特定通路級聯(lián)的完整性以及信號級聯(lián)中蛋白質(zhì)的狀態(tài)[32]。

4.2 在癌前病變和癌癥早期的作用雖然在上述一些研究中，觀察到了EAP Ⅱ在細胞凋亡中的不同作用，但EAP Ⅱ在癌癥發(fā)展中的生物學意義仍然未知。EAP Ⅱ在癌癥進展中的作用與其在細胞凋亡過程中有相似之處，即不同的癌癥類型中EAP Ⅱ的表達增高或降低。Li 等[11]的研究顯示，大多數(shù)非小細胞肺癌（NSCLC）患者的免疫組織化學實驗結(jié)果，EAP Ⅱ蛋白顯著升高（90%），并且EAP Ⅱ的表達水平和定位在肺癌發(fā)展過程中發(fā)生了變化。在高度增生的組織中細胞核染色可見EAP Ⅱ表達，大多數(shù)肺癌表現(xiàn)出細胞質(zhì)或細胞質(zhì)以及核染色。這一發(fā)現(xiàn)表明，EAP Ⅱ可能有助于促進肺癌在早期階段的發(fā)展。在小鼠NSCLC 異種移植模型中，觀察到了EAP Ⅱ表達顯著增高，證實了其致癌作用[13]。該研究支持EAP Ⅱ是肺癌發(fā)展的致癌因素的觀點。在Barrett 食管癌前病變的研究中[33]，伴隨著正常的食管鱗狀上皮演化為腸上皮化生的過程中，EAP Ⅱ表達也明顯增加。Pyeon 等[34]的研究顯示，宮頸癌和患有人乳頭瘤病毒（HPV）感染的頭頸癌患者中，EAP Ⅱ的表達上調(diào)。該研究也充分支持EAP Ⅱ促成癌癥發(fā)病機理的觀點。另一方面，在幾種類型的癌癥或癌前病變中，卻均觀察到EAP Ⅱ表達減少的現(xiàn)象。例如在一項原發(fā)性淋巴瘤細胞研究中，與非癌性T淋巴細胞和NK 淋巴細胞比較，原發(fā)性淋巴瘤細胞、原發(fā)性皮膚間變性大細胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的EAP Ⅱ表達均明顯降低[35]。Galamb 等[36]在結(jié)直腸癌的研究中顯示，與同一患者的正常組織相比，EAP Ⅱ在癌前腺瘤組織中表達下調(diào)。

4.3 在癌癥進展期的作用EAP Ⅱ在一些癌癥進展期的研究中，也觀察到EAP Ⅱ表達的變化。在小鼠浸潤性結(jié)腸癌細胞系（相對于非浸潤性細胞系）和人轉(zhuǎn)移性前列腺腫瘤（相對于原發(fā)性前列腺腫瘤）中發(fā)現(xiàn)EAP Ⅱ表達顯著下降[35，37]。Vahteristo 等[38]通過血液來源的基因表達譜顯示，多發(fā)性棘狀細胞癌的干性色素性皮膚干燥綜合征患者的EAP Ⅱ轉(zhuǎn)錄水平低于對照組。Li 等[13]的研究顯示在NSCLC細胞中EAP Ⅱ的重新表達促進細胞增殖并增強異種移植腫瘤的生長，而使用shRNA 技術(shù)的EAP Ⅱ抑制實驗則誘導了細胞凋亡并降低異種移植腫瘤的生長。使用抗體陣列的主要信號通路分析結(jié)果表明，EAP Ⅱ上調(diào)了致癌蛋白MYC 和cyclinD1。由此可見，EAP Ⅱ在這些模型中激活了細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2），但未激活JNK或p38MAPK 途徑，這表明EAP Ⅱ是Raf-ERK/MAPK 信號通路的上游因子，并且在癌癥的發(fā)展中具有致癌作用。

綜上所述，EAP Ⅱ在細胞生物學的許多方面都發(fā)揮著重要作用，包括DNA 鏈烯的拓撲纏結(jié)、細胞對微環(huán)境的反應能力、細胞存活率和細胞遷移。這些功能涉及癌癥發(fā)展的許多方面，包括染色體不穩(wěn)定、腫瘤發(fā)生、腫瘤轉(zhuǎn)移。特別是EAP Ⅱ介導的信號，包括免疫防御，炎癥反應和細胞應激（如缺氧和DNA 毒性），是腫瘤微環(huán)境編排的關鍵因素。因此，作為ERK/MAPK 信號通路的上游因子，EAP Ⅱ參與癌癥發(fā)生和發(fā)展多個環(huán)節(jié)。但目前EAP Ⅱ?qū)Π┌Y的作用機制研究尚不夠深入，其在癌癥方面的研究還有待于進一步探討。