化痰活血益氣方對異丙腎上腺素誘導的心肌肥厚大鼠神經(jīng)內分泌因子以及Akt信號磷酸化的影響*

★ 常欣峰 宋春花 龍笑影 韓立民**（.贛南醫(yī)學院 江西 贛州 34000；.贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 江西 贛州 34000）

心肌肥厚以心肌細胞肥大及心肌間質異常為基本病理改變，是心臟對血流壓力負荷增加的主要代償機制，主要見于高血壓[1]與血管疾病[2]。心肌病理性重構是心力衰竭的主要發(fā)病機制之一，神經(jīng)內分泌系統(tǒng)的過度激活是心肌病理性重構、心衰的發(fā)生發(fā)展的重要因素[3]。本研究采用異丙腎上腺素（Isoproterenol，Iso）誘導的大鼠心肌肥厚模型，擬觀察化痰活血益氣復方的抗心肌肥厚作用及對神經(jīng)內分泌因子血管緊張素（angiotensinⅡ，AngⅡ）、醛固酮（aldosterone，ALD）、內皮素-1（endothelin-1，ET-1）及Akt信號磷酸化水平的影響。

1 實驗材料

1.1 動物 雄性SD大鼠，SPF級，體重200～250g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2013—0004，飼養(yǎng)于贛南醫(yī)學院實驗動物中心。

1.2 藥物 化痰活血益氣方（法半夏10g、陳皮10g、葶藶子15g、酒丹參20g、生黃芪20g、茯苓15g、炙甘草3g）由贛南醫(yī)學院科研中心提供，經(jīng)稱重、浸泡、煎煮3次，濃縮至0.9765g/mL（含生藥）。葶藶子、陳皮、茯苓購自江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司，半夏、甘草購自江西樟樹慶仁中藥飲片有限公司，丹參購自江西樟樹彭氏國藥堂飲片有限公司，黃芪購自安徽普仁中藥飲片有限公司?？ㄍ衅绽徸越K天士力帝益藥業(yè)有限公司。

1.3 試劑 Iso（貨號：I5627-5G）購自美國Sigma-Aldrich公司，AngⅡ（貨號：CEA005Ra）、ALD（貨號：CEA911Ge）、ET-1（貨號：CEA482Ra）ELISA試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司，p-Akt（貨號：9271S）、Akt（貨號：9272S）及β-Tubulin（貨號：2128S）抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司，辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（貨號：ZB-2301）抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

2 實驗方法

2.1 動物模型建立、分組及給藥 48只雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、復方低劑量組、復方中劑量組、復方高劑量組和卡托普利組，每組8只。各組（除正常組）大鼠背部皮下注射Iso 1mg/kg，每日1次，連續(xù)10d；正常組大鼠背部皮下注射等劑量的生理鹽水。自由進食，飲水。于造模次日，各治療組開始灌胃給藥，每日兩次，每次間隔8h以上，連續(xù)14d。復方低、中、高劑量組和卡托普利組分別灌胃以化痰活血益氣方4.88，9.77，19.53mg/kg/d和卡托普利0.02mg/kg/d。給藥量按照《藥理實驗方法學》[6]所示體表面積劑量換算法計算，復方低、中、高劑量和卡托普利分別給予成年人0.5倍、1倍、2倍和1倍的等效劑量，正常組、模型組灌胃以相同體積的生理鹽水。

2.2 心臟指數(shù)測定 末次給藥后禁食、不禁水12h，稱重，10%水合氯醛麻醉（0.35 mL/100g，i.p.），腹主動脈采血后取心臟，生理鹽水洗凈，冰上去除心房組織、分離左右心室，濾紙吸干后，稱量左心室重、全心重。計算左心室重量指數(shù)（left ventricle mass index，LVMI） = 左心室重量（mg）/體重（g），全心重量指數(shù)（heart mass index，HMI） = 全心重量（mg）/體重（g）。

2.3 ELISA法檢測血清AngⅡ、ALD、ET-1含量 腹主動脈采血，置于4℃冰箱中保存，待凝血堅實、血清析出后，4℃ 3500 r/min離心10min，分離血清。按照ELISA試劑盒說明書操作，依次檢測血清AngⅡ、ALD、ET-1的含量。

2.4 Western blot法檢測心肌組織Akt蛋白水平及其活性形式p-Akt蛋白水平的表達 取50μg心肌組織蛋白樣本，經(jīng)電泳、濕法轉膜后，分別孵以一抗p-Akt（1∶200）、Akt（1∶400）及β-Tubulin（1∶1000），4℃轉移搖床過夜。TBST清洗后，孵以對應二抗（1∶1000），室溫水平搖床搖晃1h后，行化學發(fā)光。用Image Lab 5.1軟件測量蛋白條帶面積并進行灰度分析，計算p-Akt/Akt比率。β-Tubulin作為內參使用。

2.5 統(tǒng)計學方法 用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。所有數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 化痰活血益氣方對心臟指數(shù)的影響 與正常組相比，模型組的LVMI與HMI均明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，復方中劑量組的LVMI與HMI均明顯降低（P＜0.05），卡托普利組的LVMI明顯降低（P＜0.05）。結果見表1。

表1 化痰活血益氣方對心臟指數(shù)的影響（）

表1 化痰活血益氣方對心臟指數(shù)的影響（）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 n 劑量/mg·kg-1·d-1 LVMI/mg·g-1 HMI/mg·g-1正常組 8 — 2.06±0.09 2.64±0.11模型組 4 — 2.64±0.09* 3.37±0.16*復方低劑量組 5 4.88 2.50±0.11 3.25±0.12復方中劑量組 5 9.77 2.45±0.11# 3.09±0.18#復方高劑量組 6 19.53 2.54±0.10 3.29±0.14卡托普利組 5 0.02 2.47±0.09# 3.24±0.14

異丙腎上腺素可以興奮心肌β1腎上腺素受體，增快心率、增強心肌收縮力，增加心臟傳導系統(tǒng)的傳導速度，縮短竇房結的不應期，升高血壓以增加心臟壓力負荷，為心肌肥厚的常用造模藥物。經(jīng)查閱，中文文章所用異丙腎上腺素多為國產，動物死亡率相對較低。本實驗所用異丙腎上腺素購自美國Sigma公司且為近期生產，藥效好且質量有保證。在本實驗中，給大鼠皮下注射異丙腎上腺素后大鼠出現(xiàn)了心跳加快、心臟驟停乃至猝死等現(xiàn)象，大鼠死亡乃造模藥物藥效反應、機體不能代償所致。正常組、模型組及給藥組大鼠死亡數(shù)目不一，正常組無死亡，模型組死亡最多，治療組死亡較少，可能與治療藥物干預有關。

3.2 化痰活血益氣方對神經(jīng)體液因子的影響 與正常組相比，模型組的血清AngⅡ、ALD、ET-1水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，復方低、中劑量組和卡托普利組的血清AngⅡ水平，復方中劑量組的血清ALD水平以及復方中劑量組和卡托普利組的血清ET-1水平均明顯降低（P＜0.05）；在各治療組中，復方中劑量組的血清AngⅡ、ALD、ET-1水平均為最低。結果見表2。

表2 化痰活血益氣方對神經(jīng)體液因子的影響（）

表2 化痰活血益氣方對神經(jīng)體液因子的影響（）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 n 劑量/mg·kg-1·d-1 AngⅡ/pg·mL-1 ALD /pg·mL-1 ET-1 /pg·mL-1正常組 8 — 160.86±85.11 38.40±22.98 89.54±12.34模型組 4 — 422.53±83.31** 95.55±26.05** 142.03±11.35**復方低劑量組 5 4.88 267.85±104.47# 59.08±28.80 129.04±11.02復方中劑量組 5 9.77 247.17±74.19# 48.95±18.81# 113.43±15.32#復方高劑量組 6 19.53 327.57±79.12 79.93±23.56 137.79±13.15卡托普利組 5 0.02 261.83±51.60# 54.25±22.24 119.32±11.50#

3.3 化痰活血益氣方對p-Akt、Akt蛋白表達水平及p-Akt/Akt比率的影響

3.3.1 化痰活血益氣方對p-Akt、Akt蛋白表達的影響 如圖2所示，各組p-Akt蛋白的表達水平存在顯著性差異。與正常組比較，模型組的p-Akt條帶面積明顯增大；與模型組比較，復方低、中、高劑量組的p-Akt條帶面積有不同程度的減小，卡托普利組的p-Akt條帶面積無明顯增減。在各治療組中，復方中劑量組的p-Akt條帶面積最小。各組Akt、β-Tubulin蛋白的表達水平未見顯著性差異。

圖2 化痰活血益氣方對p-Akt、Akt、β-Tubulin蛋白表達的影響

3.3.2 化痰活血益氣方對p-Akt/Akt比率的影響 本實驗每組取4只大鼠，每只大鼠重復2次。與正常組比較，模型組的p-Akt/Akt比率明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，復方低劑量組和中劑量組的p-Akt/Akt比率均明顯降低（P＜0.05），復方高劑量組的p-Akt/Akt比率雖有降低但差異無統(tǒng)計學意義性（P＞0.05），卡托普利組的p-Akt/Akt比率無明顯增減（P＞0.05）。在各治療組中，復方中劑量組的p-Akt/Akt比率最低。結果見表3。

表3 化痰活血益氣方對p-Akt/Akt比率的影響（，n=8）

表3 化痰活血益氣方對p-Akt/Akt比率的影響（，n=8）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 劑量/mg·kg-1·d-1 p-Akt/Akt比率正常組 — 1模型組 — 1.98±0.68*復方低劑量組 4.88 0.79±0.32#復方中劑量組 9.77 0.68±0.57#復方高劑量組 19.53 1.52±0.58卡托普利組 0.02 1.98±0.44

4 討論

心肌肥厚是血流壓力負荷增加時的一種適應性反應[4]，然而長期持續(xù)的血流壓力超負荷會使心臟失代償，最終導致心力衰竭的發(fā)生[5]。盡管給予西藥干預，由心肌肥厚所導致的心衰的發(fā)病率和病死率仍然居高不下[6]。中醫(yī)藥是一個偉大的寶庫，抗心肌肥厚的現(xiàn)代中醫(yī)藥研究主要是以其中醫(yī)病機為依據(jù)，在相應治法的指導下，針對單味中草藥及其中藥單體和中藥復方展開的。近年來，國內外學者在研究單味中草藥及其中藥單體治療心肌肥厚方面取得了顯著進展，但基于中醫(yī)病機的中藥復方研究卻鮮有聞及。這不僅不利于本病中醫(yī)認識的發(fā)展，而且在一定程度上阻礙了中藥多組合、多靶點優(yōu)勢的發(fā)揮，影響了本病的中醫(yī)臨床治療。本研究以“痰瘀互結、正氣虧虛” 為心肌肥厚的中醫(yī)病機理論，以二陳湯為化痰的基礎方，配以化痰之葶藶子、活血之丹參、補氣之黃芪，組建了化痰活血益氣方；該方以半夏、葶藶子化痰，為君藥；丹參活血、黃芪補氣、陳皮理氣化痰，三者共為臣藥；佐以茯苓健脾利濕；炙甘草調和諸藥以為使。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活是心肌肥厚發(fā)生的重要病理機制。腎小球入球小動脈的球旁細胞分泌腎素，激活肝臟產生的血管緊張素原進而生成血管緊張素Ⅰ，血管緊張素Ⅰ經(jīng)血管緊張素轉換酶作用生成AngⅡ。AngⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的主要效應物質，具有收縮血管、升高血壓、促進ALD分泌和鈉水潴留、增強交感神經(jīng)活性、促進細胞生長和血管生成等作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ參與了心肌肥厚的形成[8]。ALD可以激活交感神經(jīng)系統(tǒng)[9]，并促進成纖維細胞增殖[10]進而導致心肌間質膠原合成增加，促進心室重構。此外，ALD還可以增加組織對AngⅡ的結合并增強AngⅡ的生物學效應[11]。內皮素（endothelin，ET）是一種具有強大收縮血管作用的活性多肽，是調控心血管功能的重要因子，也是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的刺激物[12]。ET包括ET-1、ET-2、ET-3和血管活性腸收縮肽4種亞型，其中又以ET-1活性最強。研究發(fā)現(xiàn)，ET-1可以通過激活MAPK和CaMKⅡ信號通路增加心肌的收縮性，并促進心肌細胞肥大進而導致心肌肥厚的形成[13]。

Akt信號的異常調節(jié)在腫瘤、糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病中均起著重要作用[14]，也是現(xiàn)今細胞分子機制研究的一大熱門。PI3K/Akt信號通路是病理性心肌肥厚的一條重要信號轉導通路[15]。PI3K使細胞膜4，5二磷酸磷脂酰肌醇磷酸化，并與Akt及其激活劑3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1結合，生成3，4，5三磷酸磷脂酰肌醇，進而導致Akt的磷酸化與激活[16]，活化的Akt激活相關基因的表達最終引發(fā)心肌肥厚。p-Akt/Akt比率是磷酸化的Akt與總的Akt的灰度比值，反應的是Akt的活化程度，即總的Akt中有多少比例發(fā)生磷酸化（即活化）。

本研究結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠的LVMI、HMI、AngⅡ、ALD、ET-1和p-Akt/Akt均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明Iso誘導的心肌肥厚造模成功，模型組已形成心肌肥厚。與模型組相比，復方低、中、高劑量組與卡托普利組的LVMI、HMI、AngⅡ、ALD、ET-1和p-Akt/Akt均有不同程度的降低，復方中劑量組的上述各項指標始終存在顯著性差異（P＜0.05）。這表明：①化痰活血益氣方可以有效改善Iso誘導的心肌肥厚并降低神經(jīng)內分泌因子AngⅡ、ALD、ET-1含量；②在各劑量組中，等效于成人劑量的中劑量組療效最好，且該組療效優(yōu)于卡托普利組；③該復方可能通過抑制Akt信號的磷酸化來發(fā)揮其抗心肌肥厚作用。本研究以 “痰瘀互結、正氣虧虛” 為心肌肥厚的中醫(yī)基本病機，采用化痰活血益氣方對Iso誘導的大鼠心肌肥厚模型進行干預，以明確其抗心肌肥厚作用及對神經(jīng)內分泌因子AngⅡ、ALD、ET-1及Akt信號磷酸化水平的影響，以求為心肌肥厚“痰瘀互結，正氣虧虛”的中醫(yī)病機提供了細胞生物學支持，為心肌肥厚“化痰、活血、益氣”的中醫(yī)治法提供了實驗依據(jù)，為廣大臨床醫(yī)者組方治療心肌肥厚時起到拋磚引玉、投石問路之效。