H7N9亞型禽流感油乳滅活疫苗誘導(dǎo)雞鴨鵝產(chǎn)生HI抗體的試驗(yàn)

張濟(jì)培，曹夢(mèng)蕊，張溢珊，李榮旭，劉佑明，劉敏芳，陳濟(jì)鐺，陳建紅

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231)

自2013年我國(guó)首次出現(xiàn)H7N9新型禽流感病毒以來(lái)，H7N9亞型禽流感在我國(guó)多地出現(xiàn)流行，隨著病毒的進(jìn)化，病毒從對(duì)禽表現(xiàn)為不致病或低致病性轉(zhuǎn)變?yōu)楦咧虏⌒裕?017年3月，湖南地區(qū)出現(xiàn)由高致病性H7N9亞型禽流感病毒引起大量雞死亡的病例[1]。此外，據(jù)報(bào)道，H7N9亞型禽流感病毒可以直接感染人[2-3]?？梢?jiàn)控制H7N9亞型禽流感病毒的流行對(duì)保護(hù)禽類健康和保障公共衛(wèi)生安全具有雙重意義。目前H7N9亞型禽流感疫苗正處在應(yīng)用推廣階段，為了有效防控H7N9亞型禽流感，本試驗(yàn)采用H7N9亞型流感滅活疫苗，對(duì)雛雞、雛番鴨和雛鵝3種有代表性的禽種，進(jìn)行3種程序的免疫試驗(yàn)，檢測(cè)HI抗體變化情況，企望了解本疫苗對(duì)該幾種禽的免疫原性，及篩選出適合該禽類的免疫劑量、免疫次數(shù)等指標(biāo)，為H7N9亞型流感滅活疫苗的應(yīng)用提供具體的參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡非免疫雛雞(下簡(jiǎn)稱C)，購(gòu)自佛山市高明區(qū)某種雞養(yǎng)殖場(chǎng)；1日齡非免疫番鴨(下簡(jiǎn)稱DF)，購(gòu)自佛山市順德區(qū)某種番鴨養(yǎng)殖場(chǎng)；1日齡非免疫鵝(下簡(jiǎn)稱G)，購(gòu)自肇慶市高要區(qū)某種鵝養(yǎng)殖場(chǎng)。所有雛禽嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)至2周齡，待試。

1.2 試劑器材 H7N9亞型禽流感油乳滅活疫苗(下簡(jiǎn)稱H7N9油苗)及其HI抗原，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病實(shí)驗(yàn)室提供；pH值7.2的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖生理鹽水，1%公番鴨紅細(xì)胞懸液，1%公雞紅細(xì)胞懸液，按常規(guī)配制。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 2周(14日)齡雛雞44只，隨機(jī)分成C1、C2、C3、C4共4組，11只/組。C1-C3組采用H7N9油苗肌肉注射接種，其中C1組為“2周齡0.3 mL /只”免疫組(免疫程序1)；C2組為“2周齡0.5 mL /只”免疫組(免疫程序2)；C3組為“2周齡0.3 mL/只，3周齡0.6 mL/只”免疫組(免疫程序3)；C4組為非免疫組。各組分別于接種前(接種當(dāng)天)和接種后每周經(jīng)靜脈采血，分離血清標(biāo)記，-20 ℃保存，統(tǒng)一按常規(guī)做H7N9亞型流感HI抗體效價(jià)檢測(cè)。2周齡雛番鴨44只，2周齡雛鵝44只，其分組、免疫接種及采血安排與上述雛雞一致。

1.3.2 各種雛禽H7N9亞型流感HI抗體檢測(cè)方法 血凝抑制試驗(yàn)(HI)微量法，參照《高致病性禽流感疫情處置技術(shù)規(guī)范(試行)(2004)》及朱燕秋等“水禽禽流感 H5N1 抗體檢測(cè)方法”進(jìn)行[4-5]。對(duì)雞的血清，采用1%成年公雞源紅細(xì)胞懸浮液作 HI 試驗(yàn)；對(duì)番鴨和鵝的血清，采用1%成年公番鴨源紅細(xì)胞懸浮液作 HI 試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各種雛禽各組H7亞型流感HI抗體檢測(cè)情況 見(jiàn)表1。

表1 各種雛禽各組H7N9亞型禽流感 HI 抗體(Log2)檢測(cè)情況及各周(W)均值

2.2 雛雞各組H7N9亞型禽流感HI抗體比較的情況 由表1中C1-C3組H7N9亞型禽流感HI抗體檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，雛雞應(yīng)用 H7N9 油苗，采取3種方式免疫，免疫后各周均值以 C1 組最低(3.66 Log2)，最初2周及最后1周低于4.00 Log2；C2 組各周 HI 抗體均值中等(4.09 Log2)，仍然是最初2周及最后1周低于4.00 Log2；C3 組各周 HI 抗體均值最高(4.46 Log2)，只有最初1周低于4.00 Log2。

2.3 雛番鴨各組H7N9亞型禽流感HI抗體比較情況 由表1中DF1-DF3組H7N9亞型禽流感HI抗體檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，雛番鴨應(yīng)用 H7N9 油苗，采取3種方式免疫，免疫后各周均值以 DF1 組最低(4.96 Log2)，DF2 組、DF3 組各周 HI 抗體均值相近(6.37 Log2，6.31 Log2)，顯著高于DF1 組。另外可見(jiàn)，3組均只有免疫后最初1周低于4.00 Log2。

2.4 雛鵝各組H7N9亞型禽流感HI抗體比較的情況 由表1中G1-G3組H7N9亞型禽流感HI抗體檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，雛鵝應(yīng)用 H7N9 油苗，采取3種方式免疫，免疫后各周均值以 G1 組最低(4.44 Log2)，最初3周低于4.00 Log2；G2 組各周 HI 抗體均值中等(5.02 Log2)，最初3周低于4.00 Log2；G3 組各周 HI 抗體均值最高(5.60 Log2)，最初2周低于4.00 Log2。

2.5 各種雛禽同方式免疫組H7亞型禽流感HI抗體比較情況 由表1可見(jiàn)，以免疫程序1接種H7N9油苗，HI 抗體產(chǎn)生情況最好的是番鴨(抗體水平上升較快，峰值平穩(wěn)維持時(shí)間較長(zhǎng))；次之為雛鵝(抗體水平上升較慢，但持續(xù)維持上升狀態(tài))，再次為雛雞(抗體水平上升較慢，峰值維持時(shí)間較短)。

由表1可見(jiàn)，以免疫程序2接種H7N9油苗，HI抗體產(chǎn)生情況最好的是番鴨(抗體水平上升快速，并呈持續(xù)上升趨勢(shì))；次之為雛鵝(抗體水平上升較慢，各周均低于雛番鴨，但有持續(xù)上升趨勢(shì))，再次為雛雞(抗體水平上升較慢，峰值維持時(shí)間較短)。

由表1可見(jiàn)，以免疫程序3接種 H7N9油苗，以雛番鴨產(chǎn)生的HI 抗體較好；次之為雛鵝，再次為雛雞。

2.6 各種雛禽各免疫組H7N9亞型禽流感HI抗體均值比較情況 由表1可見(jiàn)，以各種雛禽各免疫組抗體均值作比較，進(jìn)一步顯示，以 H7N9 油苗免疫誘導(dǎo) HI 抗體反應(yīng)，最好為雛番鴨，其次為雛鵝，再次為雛雞；免疫接種方式，雛雞和雛鵝，以3組優(yōu)于2組，2組優(yōu)于1組；雛番鴨，以3組、2組免疫效果較好而優(yōu)于1組。

3 討論

自2017年3月份在湖南永州發(fā)生H7N9亞型禽流感后，陸續(xù)報(bào)道在河北、河南、天津、陜西等地發(fā)生H7N9亞型禽流感疫情，引起大量雞只死亡，造成經(jīng)濟(jì)損失[6]。同時(shí)，H7N9亞型禽流感于2013年首次報(bào)道感染人以來(lái)，波及范圍不斷擴(kuò)大，造成全國(guó)多地區(qū)人感染發(fā)病、死亡[7]?？梢?jiàn)H7N9亞型禽流感病毒不僅在動(dòng)物經(jīng)濟(jì)方面造成影響，且對(duì)人類健康也存在威脅，因此加強(qiáng)H7N9禽流感的防控具有深刻的意義。

本試驗(yàn)采用H7N9油乳滅活疫苗，對(duì)雛雞、雛番鴨和雛鵝進(jìn)行免疫試驗(yàn)。結(jié)果表明，本疫苗對(duì)3種雛禽都具有良好的免疫原性。但禽的品種不同，接種劑量及次數(shù)不同，誘導(dǎo)產(chǎn)生HI抗體的強(qiáng)度亦有不同。據(jù)各種雛禽各免疫組抗體均值作總體評(píng)價(jià)，反應(yīng)效果最好為雛番鴨，其次為雛鵝，再次為雛雞；同種禽類不同程序之間評(píng)價(jià)，在雛雞和雛鵝，以程序3優(yōu)于程序2，程序2優(yōu)于程序1；在雛番鴨，以程序3與程序2較好，優(yōu)于程序1。

雛雞免疫2周后HI抗體達(dá)到4.00 Log2，免疫后各周均值可達(dá)4.46 Log2；雛番鴨免疫2周后HI 抗體達(dá)到4.91 Log2，免疫后各周均值可達(dá)到6.37 Log2；雛鵝免疫3周后HI 抗體達(dá)到4.55 Log2，免疫后各周均值可達(dá)到5.60 Log2。張濟(jì)培等[8]在番鴨作H5N1亞型禽流感的免疫保護(hù)試驗(yàn)，在人工感染的情況下，表明HI抗體在4 Log2時(shí)，大部分番鴨可以抵抗病毒感染，小部分仍然有發(fā)病，HI抗體在6 Log2或以上時(shí)，所有番鴨均可抵抗病毒感染。姜北宇等[9]也報(bào)道，采用H5亞型禽流感疫苗免疫，當(dāng)抗體HI≥6 Log2時(shí)，保護(hù)率達(dá)100%，免疫動(dòng)物能抵御禽流感強(qiáng)毒的攻擊。提示，如果以4 Log2為免疫保護(hù)臨界滴度，則為了使免疫雛禽獲得盡可能好的保護(hù)，對(duì)于雛雞和雛鵝應(yīng)采用程序3免疫接種，對(duì)于雛番鴨，則可優(yōu)先選用程序3和程序2。不同品種、不同用途的家禽可根據(jù)飼養(yǎng)時(shí)間的不同，選取適合的免疫程序?？梢愿鶕?jù)對(duì)免疫禽群的免疫監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)結(jié)果，來(lái)適當(dāng)調(diào)整免疫程序。