miRNA與電離輻射防護(hù)功能食品研究進(jìn)展

魯吉珂,陳 培,曹娜娜,陳 晨,伊娟娟,郝利民

（1.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450001；2.軍事科學(xué)院軍需工程技術(shù)研究所,北京 100010）

電離輻射是能引起物質(zhì)電離的輻射總稱,可以通過(guò)直接或間接作用電離出物質(zhì)中的原子和分子[1-2]。隨著核能的發(fā)展和核技術(shù)在能源和醫(yī)療等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,電離輻射幾乎無(wú)處不在,如果使用或控制不當(dāng),可對(duì)人類健康帶來(lái)潛在的危害與風(fēng)險(xiǎn)。電離輻射對(duì)生物體的損害表現(xiàn)為生物體內(nèi)重要器官損傷以及相關(guān)調(diào)控系統(tǒng)紊亂[3-4],這也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體造血功能、生殖系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)等不同程度的損傷[5-6],甚至發(fā)生癌變[7],其損傷程度取決于輻射種類、劑量、時(shí)間及機(jī)體的敏感性[8]。

電離輻射主要來(lái)源于宇宙射線、環(huán)境中天然放射性核素和核能應(yīng)用中的人工電離輻射源等,其中人工電離輻射源在工業(yè)、醫(yī)學(xué)診療以及軍事作業(yè)中應(yīng)用非常廣泛,是輻射防護(hù)研究的重點(diǎn)[9]。在臨床上放射治療是利用電離輻射抑制或殺滅癌細(xì)胞的一種有效手段[10-12],已廣泛應(yīng)用于多種癌癥的治療[13-16],但對(duì)正常細(xì)胞的輻射損傷仍是限制其有效利用的關(guān)鍵因素。另一方面,輻射暴露人員長(zhǎng)期在核輻射條件下工作和生活,易遭受低劑量慢性輻射。因此,如何有效防護(hù)這種慢性輻射,保障人員身體健康,具有重要的軍事價(jià)值和社會(huì)意義。

為了減少輻射對(duì)正常細(xì)胞及組織的不利影響,人們采取多種防護(hù)措施以保障作業(yè)人員的健康,如縮短輻射暴露時(shí)間、增大接觸距離、加強(qiáng)輻射屏蔽、積極使用個(gè)人防護(hù)裝備等[17]。美軍曾為作戰(zhàn)人員配發(fā)核輻射防護(hù)裝備,并開(kāi)展了相應(yīng)的防護(hù)訓(xùn)練,而開(kāi)發(fā)輻射防護(hù)劑是減輕人體電離輻射損傷的有效便捷手段之一。

輻射防護(hù)劑是應(yīng)用于輻照前后來(lái)保護(hù)機(jī)體免受輻射損傷的一類功能性制劑[18],其研究開(kāi)發(fā)已成為當(dāng)今醫(yī)療衛(wèi)生、軍事、能源等領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)之一。目前,已經(jīng)開(kāi)發(fā)的輻射防護(hù)制劑以藥物為主,如含硫化合物、細(xì)胞因子和激素等[8],但其成本較高,且有一定毒副作用,常用于高劑量急性放射病治療。與之相比,富含天然輻射防護(hù)功能因子的功能食品通過(guò)飲食調(diào)理提高機(jī)體輻射耐受性,對(duì)于長(zhǎng)期低劑量慢性輻射在效用和成本上具有特殊的優(yōu)勢(shì)。功能食品是供特定人群使用,不以治療疾病為目的,并且具有調(diào)節(jié)機(jī)體生理機(jī)能,有助于改善健康狀況或減少疾病發(fā)生的一類特殊食品。從天然產(chǎn)物或微生物代謝物中篩選制備具有電離輻射防護(hù)作用的功能食品基料,開(kāi)發(fā)輻射防護(hù)功能食品,通過(guò)飲食調(diào)理提高機(jī)體輻射耐受性或降低輻射對(duì)機(jī)體的損害,是輻射防護(hù)的一條重要途徑。目前已經(jīng)報(bào)道的天然輻射防護(hù)劑,如黃酮類、多糖類、多酚類以及皂苷類等功能因子[19],能夠通過(guò)清除自由基,促進(jìn)DNA修復(fù)并調(diào)節(jié)凋亡信號(hào)通路,以減少輻射對(duì)人體造成的造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[20-23],其作用時(shí)效長(zhǎng),成本低且無(wú)明顯毒副作用[24-25]。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate,EGCG）是綠茶中含量最高、活性最強(qiáng)的多酚類化合物,具有抗氧化、清除自由基和輻射防護(hù)等多種活性,以EGCG為主要組分的綠茶源食品一直是輻射防護(hù)食品開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)[26-27]。

1 miRNAs、表觀遺傳和食品

1.1 miRNAs與表觀遺傳

MicroRNAs（miRNAs）是真核生物中廣泛存在的一類調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼RNA,其大小約為20～25 個(gè)核苷酸[28-29]。miRNAs主要通過(guò)堿基配對(duì)的方式與靶基因mRNA特異結(jié)合[30-31],從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)[32]。在人類等哺乳動(dòng)物中至少有1/3的基因受miRNAs調(diào)控,單個(gè)miRNA可調(diào)控?cái)?shù)十個(gè)基因[33]。miRNAs在基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工、細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育、遺傳和表觀遺傳等幾乎所有的重要生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用,對(duì)miRNAs的鑒定及功能探索已成為當(dāng)前生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)和前沿。

表觀遺傳學(xué)是在不改變DNA序列的情況下,生物表現(xiàn)型發(fā)生改變,并保持相對(duì)穩(wěn)定和遺傳[34]。表觀遺傳學(xué)研究表明,環(huán)境在生物表型改變中發(fā)揮重要作用,而電離輻射是一種重要的環(huán)境因子,也是表觀遺傳學(xué)研究的重要模型。近年來(lái)研究證實(shí),表觀遺傳和miRNAs間存在著一定的聯(lián)系,不僅miRNAs的表達(dá)受表觀遺傳學(xué)調(diào)控,而且miRNAs也可通過(guò)調(diào)節(jié)DNA甲基化或組蛋白修飾等途徑影響表觀遺傳[35]。

1.2 miRNAs與食品

食品攝入是生物體與外界進(jìn)行物質(zhì)、能量和信息交換的一種方式,特定的飲食和功能食品因子會(huì)影響miRNAs的表達(dá)。體外癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí),功能食品因子可以調(diào)控miRNAs表達(dá),從而發(fā)揮抑癌作用。目前,研究較多的功能食品因子主要為多酚類物質(zhì),如EGCG、姜黃素和異黃酮等[36]。Tsang等[37]采用miRNAs芯片技術(shù),對(duì)EGCG處理前后的人肝癌細(xì)胞中miRNAs差異表達(dá)進(jìn)行分析,其中13 條miRNAs表達(dá)上調(diào),48 條miRNAs表達(dá)下調(diào),并證實(shí)EGCG可通過(guò)上調(diào)miR-16誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡。Sun等[38]對(duì)姜黃素處理人胰腺癌細(xì)胞的效果進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示姜黃素可通過(guò)上調(diào)miR-22和下調(diào)miR-199a抑制胰腺癌細(xì)胞增殖,其也可通過(guò)下調(diào)miR-186表達(dá)促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞凋亡[39]。Li Yiwei等[40]采用異黃酮處理胰腺癌細(xì)胞,可使miR-146a表達(dá)明顯上調(diào),從而抑制胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)類似,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體實(shí)驗(yàn)也證實(shí)特定的飲食可調(diào)控miRNAs表達(dá)。Tryndyak等[41]以大鼠為對(duì)象的研究發(fā)現(xiàn),甲基不足的飲食可誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生,同時(shí)也可誘導(dǎo)大鼠肝臟中miRNAs表達(dá)的顯著變化,包括miR-34a、miR-127、miR-200b和miR-16a。Cirera等[42]對(duì)一種哥廷根小型豬喂食高膽固醇飲食,并采用標(biāo)準(zhǔn)飲食作對(duì)照,結(jié)果高膽固醇組的體質(zhì)量、總膽固醇和高密度脂蛋白含量均顯著增高,而肝臟miR-122表達(dá)顯著降低。人體實(shí)驗(yàn)證實(shí),在葉酸缺陷的飲食條件下,miR-222表達(dá)顯著增強(qiáng),并且低葉酸吸收水平時(shí)人外周血中miRNAs表達(dá)水平可反映其營(yíng)養(yǎng)狀況[43]。

1.3 食品與表觀遺傳

食品和功能食品因子對(duì)生物體和細(xì)胞的作用不僅局限于生物表型及miRNAs表達(dá)差異,更為重要的是,表觀遺傳學(xué)研究表明,作為遺傳與環(huán)境重要接口的食品,其對(duì)生物體的影響可能會(huì)傳遞至后一代甚至后幾代。Sen等[44]研究發(fā)現(xiàn),孕期母親肥胖可顯著增加子代大鼠出生后肥胖的風(fēng)險(xiǎn),而采用富含VA、VC、VE等抗氧化劑的高脂飲食喂飼雌性大鼠,與高脂飲食雌性大鼠對(duì)照組相比,子代大鼠的肥胖傾向顯著降低,表明抗氧化食品對(duì)生物體氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)具有傳代作用。Zhang Junlong等[45]研究證實(shí),雌性小鼠孕期和哺乳期高脂飲食對(duì)子代有長(zhǎng)效影響,子代小鼠miRNAs表達(dá)發(fā)生顯著變化,有23 條miRNAs表達(dá)水平下調(diào)了1.5～4.9 倍,下調(diào)miRNAs主要有miR-709、miR-122、miR-192、miR-194、miR-26a、let-7a、let-7b、let-7c、miR-494和miR-483。類似地,雌性小鼠孕期和哺乳期高脂飲食可下調(diào)子代小鼠miR-122、上調(diào)miR-370表達(dá),通過(guò)調(diào)控miRNA和相關(guān)基因的表達(dá)影響子代早期脂代謝[46]。不僅如此,母親孕期飲食對(duì)子代影響具有性別特異性,Mao Jiude等[47]對(duì)孕期小鼠分別采用差異化含脂飲食,在孕期12.5 d提取胎盤RNA進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)飲食誘導(dǎo)基因差異表達(dá)具有性別特異性,營(yíng)養(yǎng)變化時(shí)雌性胎盤基因表達(dá)差異比雄性胎盤更為敏感。

食品對(duì)后代的影響不僅來(lái)自于母親,也來(lái)自于父親。Ng等[48]的研究發(fā)現(xiàn),采用高脂飲食的雄性小鼠,在追蹤其雌性后代的健康時(shí),父代的高脂飲食會(huì)導(dǎo)致雌性子代β細(xì)胞功能紊亂,削弱子代葡萄糖和胰島素的平衡從而引起代謝疾病。除此之外,Carone等[49]的研究顯示,攝入低蛋白食物的雄性小鼠的子代,其肝臟中脂肪和膽固醇表達(dá)基因較多,心臟病的發(fā)病率增加,表明父代飲食會(huì)影響子代脂肪和膽固醇代謝途徑。

2 miRNAs與電離輻射

1993 年Ambros Victor博士首次在秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)miRNA,現(xiàn)已證實(shí)miRNAs作為調(diào)控分子參與了幾乎所有的生物學(xué)過(guò)程[50],在細(xì)胞增殖、分化、凋亡過(guò)程中占據(jù)著重要的生物學(xué)地位[51]。腫瘤學(xué)研究表明,miRNAs功能失調(diào)與多種惡性腫瘤密切相關(guān)[32],不同腫瘤對(duì)應(yīng)的miRNAs可發(fā)揮致癌基因或抑癌基因的作用[52]。電離輻射是多種腫瘤尤其是白血病和淋巴癌的重要致癌因素,但其致癌機(jī)制目前尚不清楚。輻射誘導(dǎo)小鼠胸腺淋巴瘤模型表明,輻射致癌是一個(gè)多因素調(diào)節(jié)的多步驟復(fù)雜過(guò)程,包括致癌基因Ras、抑癌基因PTEN和抑癌基因p53,基因調(diào)控分子miRNAs也發(fā)揮重要作用[53]。Liu Cong等[53]對(duì)miRNAs在輻射致癌中的作用進(jìn)行了探究,采用輻射誘導(dǎo)的小鼠淋巴瘤模型,結(jié)果顯示輻射致癌胸腺組織中miR-21表達(dá)上調(diào)、抑癌基因Big-h3表達(dá)下調(diào),miR-21可以特異性靶向小鼠抑癌基因Big-h3并抑制其表達(dá)。Josson等[54]對(duì)miRNAs在前列腺癌細(xì)胞輻射處理中的調(diào)控作用進(jìn)行了研究,篩選出兩條顯著差異表達(dá)的miRNAs、miR-521和miR-34c,結(jié)果表明miRNAs可通過(guò)調(diào)控DNA修復(fù)蛋白的表達(dá),提高前列腺癌細(xì)胞的輻射敏感性。不僅如此,miRNA的表達(dá)也會(huì)影響電離輻射敏感性。miR-101的過(guò)表達(dá)抑制了鼻咽癌細(xì)胞增殖,增強(qiáng)了鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性[55],miR-15a/16通過(guò)靶向TLR1/NF-κB信號(hào)增強(qiáng)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的輻射敏感性[56]。另外,miR-30在小鼠血清中以輻射劑量依賴性方式上調(diào),在輻射誘導(dǎo)的凋亡中起關(guān)鍵作用[57]。由此可見(jiàn),miRNAs在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的輻射處理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

本課題組前期通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)4 Gy60Coγ輻射后小鼠組織中差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行篩選,結(jié)果表明在小鼠胸腺中共發(fā)現(xiàn)112 個(gè)差異表達(dá)的miRNAs（45 個(gè)已知miRNAs及67 個(gè)新的miRNAs）[58]；同時(shí),在小鼠肝臟中共發(fā)現(xiàn)48 個(gè)差異表達(dá)的miRNAs（27 個(gè)已知miRNAs及21 個(gè)新的miRNAs）[59]；其中miR-34a顯著上調(diào),這與文獻(xiàn)[59]報(bào)道結(jié)果一致。近年來(lái),miR-34a與輻射的關(guān)系備受關(guān)注[60-61]。在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中,輻射可上調(diào)miR-34a并通過(guò)調(diào)節(jié)下游分子機(jī)制誘導(dǎo)凋亡[62-63]。甚至有研究表明,miR-34a可作為機(jī)體輻射損傷標(biāo)志物[64-65]。因此,miR-34a可能是探索輻射防護(hù)作用機(jī)制的一個(gè)重要調(diào)控分子。

3 電離輻射與miR-34a信號(hào)通路

沉默信息調(diào)節(jié)因子（silent information regulator 1,Sirt1）是已經(jīng)證實(shí)的miR-34a靶基因之一[66-67],在生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[68-70]。有研究表明,一氧化碳可以通過(guò)抑制miR-34a的表達(dá),從而促進(jìn)Sirt1的表達(dá)來(lái)保護(hù)肝臟免受缺血、灌注損傷[71]。Sirt1可通過(guò)去乙酰化過(guò)程調(diào)控其下游基因,如腫瘤抑制基因p53。Sirt1可使p53第382 位賴氨酸殘基去乙酰化而抑制p53活化[72-73]。而p53是核轉(zhuǎn)錄因子,在發(fā)生DNA損傷、活性氧、癌基因激活與缺氧等遺傳毒性應(yīng)激反應(yīng)時(shí),其可通過(guò)調(diào)控下游基因引起細(xì)胞周期阻滯,影響DNA修復(fù)、誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡[74-75]。p53可與miR-34a的CpG島啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生去甲基化反應(yīng),激活miR-34a的表達(dá),從而調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡[76-78]。因此,miR-34a、Sirt1、p53三者形成一個(gè)反饋調(diào)節(jié)回路,參與細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控,這對(duì)于電離輻射防護(hù)調(diào)控機(jī)制研究非常重要。

由于miR-34a/Sirt1/p53信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),因此凋亡相關(guān)蛋白對(duì)于研究輻射防護(hù)調(diào)控機(jī)制也非常重要。目前研究比較清楚的執(zhí)行細(xì)胞凋亡的基因家族Bcl-2是由抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax組成,構(gòu)成了細(xì)胞死亡通路關(guān)鍵決定調(diào)控點(diǎn)。在細(xì)胞中,Bax被Bcl-2功能屏蔽。若Bax被活化,將發(fā)生一系列的構(gòu)象變化,使線粒體膜滲透性發(fā)生改變,促進(jìn)細(xì)胞色素c等促凋亡分子的分泌[79]。Caspase是凋亡通路的下游相關(guān)蛋白,而Caspase-3是Caspase家族中負(fù)責(zé)降解細(xì)胞基質(zhì)的重要效應(yīng)器。在應(yīng)激條件下,線粒體中釋放的細(xì)胞色素c激活Caspase-3,清除各種細(xì)胞基質(zhì),導(dǎo)致出現(xiàn)凋亡的形態(tài)特征,形成凋亡小體[80-81]。另外,Bcl-2家族被證實(shí)是p53作用的靶點(diǎn)之一,p53可調(diào)控抗凋亡蛋白Bcl-2的轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制其功能,p53還可以與促凋亡蛋白Bax的啟動(dòng)子結(jié)合,激活線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑。因此,miR-34a/Sirt1/p53信號(hào)通路及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3在細(xì)胞增殖與凋亡中發(fā)揮重要作用,其對(duì)于研究輻射防護(hù)作用機(jī)制具有重要意義。

本課題組在體外研究中發(fā)現(xiàn),60Coγ輻射可激活正常肝細(xì)胞AML-12內(nèi)miR-34a/Sirt1/p53信號(hào)通路,上調(diào)miR-34a,下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2,上調(diào)促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá),最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化損傷。采用功能食品因子EGCG預(yù)處理,可抑制miR-34a/Sirt1/p53信號(hào)通路,下調(diào)miR-34a,上調(diào)Bcl-2,下調(diào)Bax和Caspase-3的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮輻射防護(hù)功能[26]。因此,這個(gè)信號(hào)通路與天然產(chǎn)物的抗輻射機(jī)制密切相關(guān)。其后,本課題組又從免疫調(diào)節(jié)作用和抗氧化活性兩個(gè)方面對(duì)EGCG的體內(nèi)輻射防護(hù)作用進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)電離輻射能夠打破機(jī)體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)平衡,進(jìn)而對(duì)小鼠正常組織造成嚴(yán)重?fù)p傷,采用EGCG灌胃30 d可以通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠免疫活性及抗氧化活性而有效減輕輻射對(duì)小鼠脾臟及肝臟組織的損傷[27]。因此,EGCG是改善電離輻射損傷的一種有效的天然輻射防護(hù)劑,多酚類抗氧化劑具有良好的電離輻射防護(hù)功能。

4 結(jié) 語(yǔ)

輻射防護(hù)功能食品的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用,是保護(hù)電離輻射損傷的一條有效新途徑。在輻射環(huán)境、生物體和食品這三者的相互關(guān)系中,miRNAs作為調(diào)控分子可能發(fā)揮重要作用。生物體處于輻射應(yīng)激環(huán)境其miRNAs表達(dá)會(huì)發(fā)生變化,而攝入功能食品不僅可調(diào)控miRNAs表達(dá),而且這種調(diào)控可能具有傳代作用。miR-34a在電離輻射損傷和防護(hù)中發(fā)揮重要作用,電離輻射、輻射防護(hù)功能食品和miR-34a/Sirt1/p53信號(hào)通路密切相關(guān)。未來(lái)可進(jìn)一步探究天然產(chǎn)物的作用靶點(diǎn),并繼續(xù)對(duì)功能食品與環(huán)境因素相關(guān)的表觀遺傳學(xué)問(wèn)題進(jìn)行深入研究。