嗜冷菌的嗜冷機制及其應用研究進展

王宇，孫嘉蕾，韓雪

（哈爾濱工業(yè)大學化工與化學學院，黑龍江哈爾濱150001）

地球上有80%左右的表面處于15℃以下，深海地區(qū)、高寒地區(qū)、永久凍土地區(qū)以及極地地區(qū)占據(jù)了地球的決大部分。在這些極端的地區(qū)，具有嗜冷特性的古細菌、細菌和病毒等微生物得以大量繁殖，構(gòu)成了寒地地區(qū)的微生物系統(tǒng)[1]。嗜冷菌是一類菌的總稱，這類菌一般是在-15℃～20℃之間最適宜生長，由于這個溫度段與其它菌最適宜的溫度段相比要冷很多（普通細菌適應生長溫度為25℃～40℃），故得名嗜冷菌。嗜冷菌能夠在低溫環(huán)境下生長繁殖，其對低溫環(huán)境能夠做出應答并擁有自己獨特的嗜冷機制。細菌的生長需要維持細胞膜的流動性用于營養(yǎng)物質(zhì)的運輸、遺傳物質(zhì)的復制用于繁殖。低溫條件的限制就要求嗜冷菌能夠在低溫條件下實現(xiàn)物質(zhì)的運輸以及遺傳物質(zhì)的復制，這也要求嗜冷菌能夠產(chǎn)生低溫下具有活性的各種生物結(jié)構(gòu)。這類嗜冷微生物儲量豐富，是潛在的微生物資源。因其能合成分泌在極端環(huán)境下具有催化作用的酶而成為研究熱點[2]。大量的嗜冷菌構(gòu)成了一個天然的酶庫，這些酶正在逐漸被人類所利用。近年來，人們對極冷環(huán)境下能夠大量繁殖的嗜冷微生物給予了更多的關(guān)注，旨在闡明其嗜冷機制并應用于現(xiàn)代工業(yè)當中。當?shù)吞辑h(huán)保成為了人們?nèi)找孀非蟮哪繕?，尋找低溫條件下能夠保持活力的酶就成了研究的熱點問題，研究者們把目光投向給了能在低溫條件下正常生長的嗜冷菌及其產(chǎn)生的低溫條件下依然具有活性的各種酶類。目前已有多種酶類在生物降解、生物醫(yī)藥、食品紡織領域具有較成熟的應用，但依舊有許多潛在的酶類等待人們?nèi)ネ诰蚶谩１疚木C述了嗜冷菌的嗜冷機制以及其在食品領域的應用，旨在為后續(xù)嗜冷菌的研究提供新的思路。

1 嗜冷菌的嗜冷機制研究現(xiàn)狀

1.1 細胞膜流動性的調(diào)節(jié)

細胞膜作為阻止細胞外物質(zhì)自由進入細胞的屏障，既保證了細胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，同時又是細胞與外界環(huán)境進行信息交流、物質(zhì)交換的轉(zhuǎn)運媒介。維持細胞膜的流動性又是細胞實現(xiàn)信息交流、物質(zhì)交換的必要條件。通常在低溫條件下，細胞膜會因物理變化而使細胞膜的流動性降低。因此，嗜冷菌想要維持正常的生命活動就需要能夠?qū)ν饨鐪囟冉档妥龀鰬?，同時維持細胞膜的流動性[3]。

在低溫的條件下，原核細胞的細胞膜會變得堅硬，想要維持細胞正常的生長代謝，細胞膜上的脂肪酸就會發(fā)生一系列化學變化來防止細胞受到低溫損傷。其中的途徑之一就是通過修飾脂質(zhì)或者合成新的脂質(zhì)，利用凝膠到液相結(jié)晶相轉(zhuǎn)移的方式來維持膜流動性。主要的改變發(fā)生在主鏈上，在增加主鏈上的不飽和基團和甲基數(shù)量的同時，降低主鏈的鏈長增加分支。這種膜的適應過程被稱為自黏性適應。多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）是指含有兩個或兩個以上雙鍵且碳鏈長度為18～22個碳原子的直鏈脂肪酸。與單不飽和脂肪酸相比，多不飽和脂肪酸具有更低的熔點，因此，增加多不飽和脂肪酸的含量能夠增加細胞膜的流動性。不同類型的細菌合成不飽和脂肪酸的方式不同，厭氧細菌通過從頭合成的途徑合成不飽和脂肪酸，而好氧細菌則是采用先合成再修飾的方式合成的[4]。Stanislava等[5]研究發(fā)現(xiàn)南極嗜冷黃桿菌屬在冷適應性反應中主要有兩種膜流動性的作用機制。第一種機制是基于脂肪酸的不飽和度；第二種機制是基于合成支鏈脂肪酸。Chintalapati等[3]研究發(fā)現(xiàn)，細菌除了可以通過改變脂肪酸的組成來調(diào)節(jié)細胞膜的流動性之外，還可以通過改變脂質(zhì)頭部、膜的蛋白質(zhì)含量、合成的類胡蘿卜素的類型以及順反式脂肪酸的比例來改變細胞膜的流動性。除了脂肪酸，脂質(zhì)雙分子層中的蛋白也被認為是維持細胞膜穩(wěn)定性的重要原因。Maayer等[6]研究發(fā)現(xiàn)膜轉(zhuǎn)運蛋白的上調(diào)能夠抑制低溫條件下擴散速率和轉(zhuǎn)運速率的降低。隨著生物信息學的發(fā)展，又將研究擴大到了小分子物質(zhì)。通過對嗜冷菌和嗜溫菌的膜蛋白進行比較生物信息學分析揭示了嗜冷菌同嗜溫菌膜蛋白的氨基酸組成的不同，位于雙層外部的序列中的異亮氨酸的增加可能是由于異亮氨酸的疏水性和螺旋去穩(wěn)定性導致細胞膜的穩(wěn)定性降低同時柔韌性增加。此外，膜蛋白中丙氨酸的減少可減少螺旋的形成從而降低細胞膜的穩(wěn)定性[7]。

近年來，關(guān)于嗜冷菌細胞膜流動性的調(diào)節(jié)研究主要是通過調(diào)節(jié)細胞膜的脂肪酸組成（脂肪酸不飽和度、脂肪酸鏈長和分支等），以及細胞膜中的其他化學成分（蛋白質(zhì)、膽固醇和胡蘿卜素等）。隨著生物信息學的發(fā)展，將維持嗜冷菌細胞膜的流動性定位到了氨基酸等小分子層面，關(guān)于維持細胞膜流動性的動態(tài)變化機制依舊是今后的研究熱點。盡管目前對嗜冷菌的細胞膜的獨特結(jié)構(gòu)有了一定的了解，也簡單的解釋了嗜冷菌細胞膜能夠抵抗外界低溫環(huán)境的原因，但是對于其特殊結(jié)構(gòu)的形成以及作用機理并未能做出詳細透徹的解釋。在今后的研究中，對于嗜冷菌細胞改變細胞膜流動性的代謝通路還需要進行進一步的研究，代謝通路的研究也可為其他物種適應低溫環(huán)境提供有效的指導意義，旨在低溫條件下能夠?qū)崿F(xiàn)工廠化生產(chǎn)，有效的降低生產(chǎn)成本。

1.2 抗凍蛋白

抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs）是一類具有提高生物抗凍能力的蛋白質(zhì)類化合物的總稱。它們首先在南極魚的血液中被發(fā)現(xiàn)，隨后在細菌、真菌、硅藻、植物、昆蟲和甲殼類動物中均有發(fā)現(xiàn)。在自然界中存在各種類型的具有不同結(jié)構(gòu)的AFPs，糖基化和酯化是最常見的AFPs修飾方法，AFPs的分子量一般為2 kDa～50 kDa[8]。AFPs具有兩種不同的活性：熱滯活性和冰重結(jié)晶抑制活性[9]。這些活性都歸功于AFPs對冰的親和力。AFPs能改變冰晶的結(jié)構(gòu)并抑制冰的重結(jié)晶來保護細胞膜免受冷凍損傷，從而保證嗜冷微生物在低溫條件下的正常存活。有研究發(fā)現(xiàn)，AFPs通過不可逆的結(jié)合特定的冰晶面起作用，從而阻止二次成核并形成獨特的冰形態(tài)。由于開爾文效應的存在，吸附的AFPs之間的冰表面發(fā)生膨脹致使冰面的局部彎曲，也導致了熱滯后效應的出現(xiàn)[9]。從魚類到植物再到細菌，許多生物都通過AFPs來延緩冷凍或者減少冷凍和解凍時造成的傷害。

Duman等[10]首次證明了AFPs存在于冷適應細菌中，莫拉式菌是第一個被報道的可以產(chǎn)生AFPs的菌株。Muryoi等[11]利用由分離的AFPs的部分氨基酸序列設計的引物，通過PCR和反向PCR克隆具有編碼473個氨基酸的開放閱讀框的DNA片段。預測的基因產(chǎn)物AFP-A在大腸桿菌中表達產(chǎn)生了用糖和脂質(zhì)修飾的分子量為72 kDa的胞內(nèi)蛋白。Yamashita等[12]從南極洲羅斯島篩選出了6株能產(chǎn)生防凍蛋白的細菌。其中，被鑒定為莫拉式菌產(chǎn)生的抗凍蛋白具有活性最高。其產(chǎn)AFPs的最佳溫度和pH值分別為5℃和7.0。上清液中的AFPs經(jīng)60%硫酸銨部分純化，僅從聚丙烯酰胺凝膠電泳洗脫得到分子量為52 kDa的蛋白條帶，發(fā)現(xiàn)其通過形成六方晶體顯示出抗凍活性。通過脂質(zhì)染色試驗和酶處理證實了該AFP是一種脂蛋白，并且沒有冰成核活性。

Hashim等[13]對嗜冷酵母Glaciozyma antarctica基因組進行測序鑒定出了一種新的抗凍蛋白基因，該cDNA編碼了含有177個氨基酸的蛋白質(zhì)AFP-1。通過實時定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）定量了 AFP-1 的表達水平，在-12℃下生長6 h內(nèi)檢測到最高表達水平。將該抗凍蛋白的cDNA克隆到大腸桿菌表達系統(tǒng)中，重組AFP-1在大腸桿菌中的表達導致包涵體的形成，隨后用尿素處理使其變性并在體外再折疊，重組AFP-1的熱滯值高達0.08℃。隨后，Tab等[14]將來自Glaciozyma antarctica的重組AFP-1在甲基營養(yǎng)酵母中過表達，在16℃和pH 5.0的條件下，獲得AFP-1的最高產(chǎn)量39.5 mg/L。通過熱滯后和重結(jié)晶抑制顯示出抗凍活性，且活性與蛋白質(zhì)濃度相關(guān)。AFP-1的活性受溫度影響，在溫度高于20℃時活性顯著降低，這也說明AFPs是針對低溫環(huán)境產(chǎn)生的特異性應答。

近年來，出現(xiàn)了關(guān)于抗凍蛋白的大量的報道。眾多學者都從嗜冷微生物中發(fā)現(xiàn)了抗凍蛋白，并對其抗凍效果進行了比較研究，利用克隆的方法來生產(chǎn)出目標抗凍蛋白是目前主流的研究方法，大腸桿菌是常用的工程菌。克隆法因其操作方便，同時生產(chǎn)效率高備受研究者的喜愛，但利用克隆法生產(chǎn)出的抗凍蛋白可能與原始的抗凍蛋白具有結(jié)構(gòu)上的差異。另外，關(guān)于抗凍蛋白的結(jié)構(gòu)及其構(gòu)效關(guān)系研究的并不透徹，并沒有詳細的文獻闡明抗凍蛋白提高細胞抗凍能力的機制。今后，對抗凍蛋白的構(gòu)效關(guān)系的研究可能會成為熱點，構(gòu)效關(guān)系的闡明也對蛋白改造具有重要的指導借鑒意義。

1.3 冷休克蛋白

冷休克是細胞在低溫條件下發(fā)生的休克反應，它是細胞膜、核糖體、核酸和蛋白質(zhì)等不同水平的特異性反應。嗜冷微生物長期處于低溫環(huán)境下，為了保持正常的生長繁殖，則需要對冷休克反應做出特異性的應答。嗜冷微生物在低溫條件下會誘發(fā)產(chǎn)生冷休克蛋白（cold shock proteins，CSPs）抑制冷休克反應，幫助嗜冷微生物適應低溫條件[15]。冷休克蛋白可以與單鏈核酸結(jié)合并充當RNA伴侶以調(diào)節(jié)翻譯。冷休克蛋白在冷休克適應階段達到最高值，隨后冷休克蛋白的合成速度下降，并維持一個相對穩(wěn)定的水平。

Goldstein等[16]研究發(fā)現(xiàn)將處于指數(shù)生長的大腸桿菌從37℃轉(zhuǎn)移到10℃時，顯著誘導產(chǎn)生一種分子量為7.7 kDa的蛋白質(zhì)，并命名為CS7.4。當溫度處于10℃時，CS7.4的產(chǎn)率在1 h～1.5 h內(nèi)達到總蛋白合成的13%，隨后下降到較低的基礎水平。CS7.4的表達調(diào)控非常嚴格，在37℃時檢測不到該蛋白的合成。因此，可以得出該蛋白是菌體對低溫環(huán)境做出的特異性應答。接著，Goldstein等又克隆了編碼該蛋白的基因，并完成了核苷酸序列分析，發(fā)現(xiàn)該基因編碼了含有70個氨基酸殘基的親水性蛋白，但并未對其結(jié)構(gòu)進行闡明。Lee等[17]通過對單增李斯特菌的冷休克蛋白Lm-CspA研究顯示，該蛋白是五鏈β-桶結(jié)構(gòu)，具有疏水核心和兩個鹽橋。Lm-CspA具有較低的熔融溫度（40℃），表面環(huán)長、疏水中心少、鹽橋多和靜電斥力差可能是造成Lm-CspA熱穩(wěn)定性差的關(guān)鍵因素。

1.4 冷活性酶

酶是由活細胞產(chǎn)生的、對其底物具有高度特異性和高度催化效能的蛋白質(zhì)或RNA?；罴毎麅?nèi)每時每刻都在進行著大量的酶促反應，來維持細胞正常的生命活動。由于嗜冷菌獨特的低溫環(huán)境，要求嗜冷菌在低溫條件下能夠完成一系列生化反應，也就要求嗜冷菌具有能在低溫下具有活性的酶。

Bai等[18]從天山永久凍土分離出36株冷適應菌株，經(jīng)鑒定11株可產(chǎn)生冷活性蛋白酶，3株可產(chǎn)生冷活性淀粉酶，11株可產(chǎn)生冷活性脂肪酶，8株可產(chǎn)生冷活性纖維素酶。Morita等[19]從由雪覆蓋的土壤和深海魚中分離的細菌中獲得了3種蛋白酶，它們對低溫表現(xiàn)最高活性，在溫度達到30℃時活性消失，說明這3種酶具有冷活性。通過16S rRNA分析，3種酶中活性最高的酶來自黃桿菌，該菌的最佳生長溫度為20℃，但在10℃下存在較高量的蛋白酶活性。

Alquati等[20]發(fā)現(xiàn)由莓實假單胞菌產(chǎn)生脂肪酶在低溫下具有活性，并通過同源性建立了其三維結(jié)構(gòu)模型，并與銅綠假單胞脂肪酶（45%序列同一性）和洋蔥伯克霍爾德氏菌脂肪酶（38%序列同一性）進行比較。模型中鑒定了已知脂肪酶共有的催化三聯(lián)體（S80、D238和H260）和氧陰離子孔（L17和Q84）；蛋白質(zhì)表面暴露的大量帶電殘基在冷適應中被反復修飾；保守的二硫橋可能是有助于提高冷活性酶的活性。

迄今為止研究的大多數(shù)嗜冷酶的特征是在低溫到中溫條件下具有更高的催化活性，與嗜溫和嗜熱的同源性酶相比，冷活性酶的最佳溫度更低，但穩(wěn)定性差。冷活性酶通過降低活化焓ΔH降低了活化能ΔG和反應的溫度依賴性。近年來，眾多技術(shù)都被應用于冷適應酶的結(jié)構(gòu)和功能的分析。但由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的復雜性，及其變化的多樣性，增加了分析的難度，需要進一步進行比較研究。盡管使用如核磁共振等較先進的技術(shù)能夠較好的分析冷適應酶的靈活性，但還存在很多的局限性。目前普遍認為，嗜冷菌產(chǎn)生的冷活性酶具有很高的靈活性，通過增加可塑性和特性區(qū)域或者整個蛋白的靈活性來克服低溫的挑戰(zhàn)。在這種結(jié)構(gòu)層面，這種增加的靈活性主要是通過減少穩(wěn)定相互作用的數(shù)量或強度來實現(xiàn)，例如氫鍵、鹽橋、芳香相互作用、二硫鍵、離子結(jié)合位點和疏水相互作用。關(guān)于冷適應酶的靈活性的構(gòu)效關(guān)系還需進一步研究。

酶作為細胞內(nèi)一系列生化反應的高效催化劑，它嚴重影響著生物體生長代謝的每個階段。冷活性酶由于其獨特的低溫活性，在眾多領域都有巨大的應用潛力，因此提高酶的生成量以及優(yōu)化酶的分離純化方法，將是今后工業(yè)應用上的研究重點。想提高冷活性酶的產(chǎn)量，則必須闡明酶的生物合成途徑，了解酶的代謝通路。通過提高目標酶合成途徑的關(guān)鍵酶的活性來提高目標酶的產(chǎn)量和抑制反饋調(diào)節(jié)抑制將會是未來研究的重點。另外，關(guān)于冷適應酶的低溫活性機制也沒有得到詳細的闡述。

2 嗜冷菌在食品領域的應用

盡管有大量研究報道，嗜冷菌是影響乳及乳制品品質(zhì)的重要因素之一，其產(chǎn)生的胞外蛋白酶和脂肪酶具有一定的耐熱性，在加熱滅菌后仍能保持一部分活性，在乳及乳制品的儲藏過程中殘存的具有活力的酶會繼續(xù)對蛋白質(zhì)、脂肪底物進行分解，產(chǎn)生小分子的具有不利氣味的小分子肽和脂肪酸，影響乳及乳制品的品質(zhì)。但也正是因為嗜冷菌產(chǎn)生的酶具有低溫活性和熱抵抗性，從而可以應用于眾多領域，本文綜述了嗜冷菌在食品領域的應用。

事實上，冷活性酶在食品工業(yè)中是一種非常強大的工具。為了避免對食品口感、質(zhì)地和營養(yǎng)價值造成不利影響，同時也為了節(jié)約能源，在低溫條件下處理食品的趨勢越來越明顯[21]。目前世界上約有30%的人口患有乳糖不耐癥，乳糖不耐癥影響著乳糖不耐癥人群對牛奶的攝取，Nam等[22]研究發(fā)現(xiàn)假交替單胞菌KNOUC808具有產(chǎn)β-半乳糖苷酶的能力，該菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶能夠在相對低溫條件下將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖，該乳糖水解酶的最佳溫度和pH值分別為20℃和7.8，該酶在4℃條件下有效期為7 d，但在37℃時活性下降到初始活性的50%左右。研究發(fā)現(xiàn)，從嗜冷菌中分離出的冷活性β-半乳糖苷酶在工廠的循環(huán)使用過程中活性損失較小，在每次反應過程中僅損失5%（90℃）和1%（10℃）的活力，在最佳條件下反應10個循環(huán)依舊能保持54%（90℃）和88%（10℃）的活力剩余[23]。馬宏偉等[24]從高山凍土和乳制品中分離出的25株嗜冷菌篩選出1株高產(chǎn)β-半乳糖苷酶的菌株C，并發(fā)現(xiàn)在4℃低溫的條件下，該酶的依然具有30%的活力，如果能將該酶應用到乳制品中，那么將會在較低溫條件下進行乳糖的分解，同時可以降低反應體系能量，節(jié)約能源降低成本，這也將會是乳糖不耐癥患者的福音。

另一方面，嗜冷菌在果蔬加工領域也有著重要的作用。Adapa等[25]考慮使用從嗜冷微生物獲取的冷活性的果膠酶來代替常規(guī)果膠酶，來適應低溫加工的新趨勢。葡萄酒行業(yè)也是冷活性果膠酶潛在應用領域，葡萄酒是通過發(fā)酵工藝產(chǎn)生的，與其他發(fā)酵工藝相反，葡萄酒房角需要在低溫條件下（10℃～15℃）下進行。果膠酶在葡萄酒領域主要有以下方面：（1）從葡萄中提取有效的汁液；（2）將發(fā)酵醪中的懸浮顆粒沉淀；（3）釋放色素以及香氣。Margesin等[26]研究發(fā)現(xiàn)，從酵母菌和真菌中分離出來的冷活性果膠酶被認為能增加揮發(fā)性化合物的產(chǎn)生和保留，從而改善葡萄酒的芳香特性。從嗜冷菌中分離出的聚半乳糖醛縮酶也在果汁領域具有重要的應用，一種名叫Endo-PGⅠ的聚半乳糖醛縮酶能夠使木瓜汁的濃度降低17.6%，透光率提高59.1%。與商品果膠甲酯酶一同使用，協(xié)同度大于1.25[27]。隨后，有研究表明從黃曲霉屬中分離出的一種酸性的、冷活性的果膠甲酯酶PE8F46能夠與乳酸鈣結(jié)合來顯著增加菠蘿的硬度[28]。因此，考慮到低溫條件下對果蔬品質(zhì)的影響，恰當?shù)睦浠钚悦笇枪呒庸ば袠I(yè)的理想選擇。

在淀粉加工領域嗜冷菌也具有重要的應用。木聚糖酶可以水解面粉中的β-1，4木聚糖，用于提高面包質(zhì)量，而冷活性的木聚糖酶能夠在面團低溫情況下有效的水解β-1，4木聚糖。Struvay等[29]研究發(fā)現(xiàn)，由南極浮游假交替單胞菌產(chǎn)生的冷活性木聚糖酶能有效的改善面團的力學性能和面包的最終品質(zhì)，是一種潛在的工業(yè)面團調(diào)理劑。來自嗜冷微生物的抗凍蛋白具有抑制冰晶的重結(jié)晶作用，將抗凍蛋白應用于冰淇淋等冷凍食品來增加其細膩口感也是一種重要的潛在應用。抗凍蛋白還具有作為冷凍保護劑的明顯潛力，并已被證明能夠提高生物材料和冷凍保存效率和解凍后的生存能力。如果能將抗凍蛋白應用于材料的保護中去，那么將有極大的潛力來降低材料在冷凍儲藏過程中的損傷情況，將極大的提高材料的利用率并降低成本。

隨著嗜冷微生物在食品中應用的增加，對其安全性的評價刻不容緩。部分嗜冷菌屬于條件致病菌，在對其進行食品上的應用前，對其進行安全性評價則成為必要步驟，用以保障食品安全。嗜冷微生物在食品領域中的應用主要是其產(chǎn)生的具有獨特生物學特性的酶類發(fā)揮作用，因此在分析目標酶在食品中的應用過程中，也要將目光聚焦在通過人為改變培養(yǎng)條件或者人為改造微生物的代謝通路來提高目標酶的產(chǎn)量。通過改變培養(yǎng)條件來確定目標微生物的最適產(chǎn)酶條件是最常見的提高產(chǎn)量的方法，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，通過改變微生物的代謝通路，挖掘目標酶合成的關(guān)鍵蛋白并進行調(diào)控以及反饋抑制的解除日漸成為了研究的重點。與此同時，優(yōu)化目標酶的分離純化途徑也將是今后研究的重要熱點。

3 總結(jié)

近年來，嗜冷菌及其嗜冷機制成為了研究熱點，由于嗜冷菌獨特的生存環(huán)境要求其自身具備能在低溫環(huán)境下實現(xiàn)所有的生命活動。其中，不飽和脂肪酸、抗凍蛋白、冷休克蛋白以及冷活性的產(chǎn)生幫助其實現(xiàn)生命活動的正常進行，同時這些生物分子也在生物降解、食品醫(yī)藥等領域具有良好的發(fā)展前景。本文旨在綜述嗜冷菌的嗜冷機制及其應用，為今后嗜冷菌的研究提供新思路。