氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)測(cè)定煙酸普魯卡因中的對(duì)甲基苯胺

徐森彪

(英格爾檢測(cè)技術(shù)服務(wù)(上海)有限公司，上海 201109)

鹽酸普魯卡因能使神經(jīng)細(xì)胞興奮閾值升高，喪失興奮性和傳導(dǎo)性，信息傳遞被阻斷，臨床上具有良好的局部麻醉作用，但鹽酸普魯卡因在生產(chǎn)和貯存中都容易產(chǎn)生特殊性雜質(zhì)對(duì)氨基苯甲酸(PABA)，PABA在一定條件下還會(huì)脫羥形成有毒的苯胺，從而影響鹽酸普魯卡因藥品的質(zhì)量，同時(shí)也增加了藥品在服用過(guò)程中的風(fēng)險(xiǎn)和不確定性.對(duì)甲基苯胺是強(qiáng)烈的高鐵血紅蛋白形成劑，并能刺激膀胱尿道，致血尿，為了保證鹽酸普魯卡因藥品的質(zhì)量安全，建立鹽酸普魯卡因中對(duì)甲基苯胺含量快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)十分必要.

目前，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有對(duì)甲基苯胺的檢測(cè)方法.一般而言，對(duì)于有機(jī)化合物的檢測(cè)比較常用的方法主要包括氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS).近年來(lái)，由于質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度高、定性定量穩(wěn)定可靠以及抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)被廣大檢測(cè)工作者所認(rèn)可，使得色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法應(yīng)用廣泛.

本研究建立了一種鹽酸普魯卡因中對(duì)甲基苯胺的GC-MS分析方法.該方法具有前處理簡(jiǎn)單、檢出限低、準(zhǔn)確度和精密度高的優(yōu)點(diǎn).

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

(1) 儀器：7890B-7000D型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司)；

(2) 電子天平(Sartorius，BSA224S)：德國(guó)賽多利斯公司，感量為0.1 mg;

(3) 超純水系統(tǒng)：Milli-Q型，密理博中國(guó)有限公司；

(4) 渦旋混合器： VORTEX 3000型，德國(guó)Wiggens公司；

(5) 試劑：對(duì)甲基苯胺(Dr.Ehrensorfer，德國(guó)，純度：99.5%，Lot：114193)；

對(duì)甲基苯胺貯備液Ⅰ：差減法稱(chēng)取對(duì)甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)品0.024 3 g于10.00 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，計(jì)算得濃度為2 430 μg/mL.

對(duì)甲基苯胺貯備液Ⅱ：移液槍準(zhǔn)確移取205 μL對(duì)甲基苯胺貯備液Ⅰ于10.00 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，計(jì)算得濃度為50 μg/mL.

對(duì)甲基苯胺貯備液Ⅲ：移液槍準(zhǔn)確移取100 μL對(duì)甲基苯胺貯備液Ⅱ于10.00 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，計(jì)算得濃度為500 ng/mL.

(6) 甲醇：HPLC級(jí)，賽默飛世爾(中國(guó))有限公司.

(7) 實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水，符合 GB/T6682-2008 要求.

1.2 方法原理煙酸普魯卡因樣品中的對(duì)甲基苯胺經(jīng)甲醇提取，凈化后經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)，根據(jù)保留時(shí)間、碎片離子質(zhì)荷比及其豐度定性，與校準(zhǔn)曲線比較定量.

1.3 儀器工作條件色譜條件：DB-624色譜柱(30 m×0.32 mm×1.8 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)，程序升溫60 ℃(2 min)-5 ℃/min-100 ℃(0 min)-20 ℃/min-260 ℃(3 min)，柱溫60 ℃；進(jìn)樣口220 ℃，進(jìn)樣量1 μL，流速1.5 mL/min；進(jìn)樣模式：分流進(jìn)樣；分流比：50∶1；

質(zhì)譜條件：傳輸線溫度270 ℃，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度100 ℃，電離模式：EI，掃描模式：SIM，m/z 106.1/107.1/77.1，碰撞能量：70 eV.

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 樣品處理 稱(chēng)取0.200 0 g樣品，置于20 mL刻度管中，加入5 mL甲醇，室溫震蕩提取10 min后，于4 ℃下4 500 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，吸取上清液1 mL過(guò)0.22 μm針式尼龍濾膜于色譜進(jìn)樣瓶中，上機(jī)測(cè)試.

1.4.2 分析步驟 在6只10.00 mL容量瓶中，分別加入對(duì)甲基苯胺貯備液Ⅲ 0.00、0.15、0.30、0.50、1.00、2.00 mL，用甲醇定容至刻度，即得0.00、15.0、30.0、50.0、100、200 ng/mL對(duì)甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)系列.

2 結(jié)果

準(zhǔn)確配制一系列不同濃度對(duì)甲基苯胺的低濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按本方法進(jìn)樣，獲取標(biāo)準(zhǔn)品信噪比結(jié)果.直至信噪比接近3∶1，將該溶液進(jìn)樣6次，檢出濃度為2.50 ng/mL，以稱(chēng)樣量0.200 g，定容體積10.00 mL計(jì)算，得檢出限為0.125 mg/kg.

表1 對(duì)甲基苯胺檢出限信噪比數(shù)據(jù)

Quantitation results

CompoundRTTransition(T)Transition(Q)T-rsepQ-rsepS/NR2Final conc.UnitsP-toluidine14.353106.1107.179 90961 1299.60.997 732.052 8ng/mL

圖1 對(duì)甲基苯胺檢出限濃度色譜圖

表2 回收率試驗(yàn)(n=3)

圖2 空白稀釋液譜

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白稀釋液、樣品溶液、對(duì)甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液加標(biāo)測(cè)得值穩(wěn)定，不存在干擾現(xiàn)象.

2.5 耐用性實(shí)驗(yàn)為考察本方法測(cè)試條件在略微改變的狀況下對(duì)準(zhǔn)確性的影響，分別略微改變進(jìn)樣口溫度(±1 ℃)，流速(±0.1 mL/min)及柱溫起始溫度(±1 ℃).配制對(duì)甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行進(jìn)樣5次，并計(jì)算其濃度和回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD/%).

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，略微改變進(jìn)樣口溫度(±1 ℃)，流速(±0.1 mL/min)及柱溫起始溫度(±1 ℃)，本方法在對(duì)甲基苯胺的保留時(shí)間和響應(yīng)值方面無(wú)顯著影響.

圖3 對(duì)甲基苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液(32 ng/mL)譜

圖4 樣品溶液譜圖(樣品溶液濃度為20 mg/mL)

3 討論

3.1 儀器選擇GC-MS是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物，用電子轟擊方式得到的譜圖可以與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)(NIST譜庫(kù))進(jìn)行比對(duì).HPLC-MS主要解決極性、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定和大分子量化合物的分析.對(duì)甲基苯胺沸點(diǎn)200 ℃，分子質(zhì)量107.15，相對(duì)密度0.961 9(20.4 ℃)，能隨水蒸氣揮發(fā)，鑒于其物理化學(xué)性質(zhì)，選擇使用GC-MS分析鹽酸普魯卡因中對(duì)甲基苯胺的含量.

圖5 樣品溶液加標(biāo)(加標(biāo)濃度32 ng/mL)譜

表3 對(duì)甲基苯胺耐用性結(jié)果(n=5)

3.2 提取條件的選擇鹽酸普魯卡因在水中易溶，在乙醇中略溶，在氯仿中微溶，在乙醚中幾乎不溶，根據(jù)目標(biāo)化合物對(duì)甲基苯胺微溶于水，溶于甲醇、乙醇、乙醚、二硫化碳和油類(lèi)，溶于稀無(wú)機(jī)酸并生成鹽的性質(zhì)，采用加標(biāo)回收試驗(yàn)方法，比較了乙醇、乙醚、二硫化碳和甲醇4種不同提取試劑對(duì)鹽酸普魯卡因中對(duì)甲基苯胺的提取效率.結(jié)果證明，采用甲醇和乙醇作為提取試劑時(shí)，回收率較高，尤其是選用甲醇提取的回收率更好，乙醚和二硫化碳回收率偏低，不能滿(mǎn)足測(cè)定的要求.因此選擇了甲醇作為對(duì)甲基苯胺的提取試劑.

在室溫下震蕩提取鹽酸普魯卡因中對(duì)甲基苯胺5、10、15、20、25 min的提取效率，結(jié)果表明，10 min以后并無(wú)明顯增加，因此，確定提取時(shí)間為10 min.

3.4 色譜條件優(yōu)化快速有效分離一個(gè)復(fù)雜樣品，并獲得滿(mǎn)意結(jié)果，除了選擇一根合適的色譜柱以外，還要對(duì)分離操作條件進(jìn)行仔細(xì)的選擇.

本研究比較了1 μL和2 μL的進(jìn)樣量，進(jìn)樣量1 μL時(shí)峰形更好，氣化更充分；柱溫是一個(gè)重要的操作參數(shù)，直接影響分離效能和分析速度，在分流比為50∶1，柱溫60 ℃條件下，色譜峰分離良好.對(duì)甲基苯胺的沸點(diǎn)為200 ℃，因此選擇進(jìn)樣口溫度為220 ℃，程序升溫最高溫度為260 ℃，從而保證樣品溶液能夠完全氣化和在色譜中分離流出.

本研究采用GC-MS聯(lián)用法測(cè)定鹽酸普卡因中對(duì)甲基苯胺的含量，方法靈敏，操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高.方法線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度、專(zhuān)屬性和耐用性均能滿(mǎn)足檢測(cè)的要求.