miR-372在前列腺癌中的表達及對前列腺癌細胞遷移的影響

周 亮，向 濱，潘玉龍，何 犇，陳永江，卓 暉，李 強

(成都市第三人民醫(yī)院泌尿外科，四川成都 610031)

前列腺癌的發(fā)生發(fā)展是多基因協(xié)同作用的過程，微小RNA(microRNA，miRNA)作為信使RNA的調節(jié)因子，在腫瘤細胞的基因調控中發(fā)揮重要作用。近年來大量研究顯示miRNA與前列腺癌的發(fā)生和進展密切相關[1-2]。為闡明前列腺癌分子生物學機制指明了新的研究方向。miR-372屬于miR-371-3基因簇，可轉錄成多順反子，miR-371-3的前體為pri-miR-371-3，能形成4種成熟的miRNAs (miR-371、miR-372、miR-373和miR-373P)[3]。近來有報道顯示miR-372與腎癌、腸道腫瘤、神經膠質瘤的進展密切相關[4-6]。但是與前列腺癌相關性的報道極少，本課題組設計相關實驗，對miR-372在前列腺癌中的表達及對前列腺癌細胞遷移的影響初步報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集2017年以來在我院行前列腺穿刺或前列腺癌根治手術患者的標本及臨床病理資料，所有腫瘤標本最后均確認為前列腺癌。新鮮標本編號，一部分放入液氮罐轉移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，一部分送病理科。最后取有效標?4例，患者平均年齡73(58～82)歲、Gleason評分≥7分47例、轉移病例36例、分期≥T2期38例。所有標本均向患者及家屬說明實驗目的和過程，報醫(yī)院倫理委員會并簽署知情同意書。人前列腺癌LNCaP、DU145細胞系由廣州萊德爾生物科技有限公司提供。

1.2 主要試劑RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清等細胞培養(yǎng)相關試劑、cDNA 合成和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)采用 Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit試劑盒，均購買自美國Gibico公司；Trizol試劑購買自美國Invitrogen公司；miRNeasy提取試劑盒購買自美國Qiagen公司；轉染試劑LipofectamineTM2000購買自美國Invitrogen公司；miR-372引物、無關對照miR-372 negative control(NC)、miR-372 mimics(模擬物)和miR-372 inhibitor(抑制物)委托上海吉瑪基因公司設計并合成。

1.3 實驗方法

1.3.1miR-372在前列腺癌和癌旁組織中的表達 前列腺癌和癌旁組織分離由我院病理科采用激光顯微切割方法進行。采用Trizol試劑將組織中的總RNA(含miRNAS)提取出來，采用 TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit 合成 cDNA(含特異性引物)； 依據(jù)TaqManTMMicroRNA Cells-to-CTTMKit 說明書進行qRT-PCR，檢測miR-372的表達，U6為內參，miR-372上游引物5′-AAAGTCATAGCATAGAGTGACCTC-3′，下游引物5′-GGGATCAGAGTATAGCCTGAATTA-3′。反應體系及程序如下：cDNA 模板(2 μL)，SYBER Green Master Mix(5 μL)，前向引物(1.5 μL)，反向引物(1.5 μL)，ddH2O(1 μL)；95 ℃ 15 min，94 ℃15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 34 s。以2-ΔΔCt計算miR-372的相對含量。

1.3.2前列腺癌DU145和LNCaP細胞培養(yǎng) 前列腺癌DU145和LNCaP細胞用含10%(質量分數(shù))胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基、于37 ℃含5%CO2(體積分數(shù))的培養(yǎng)箱中孵育。每2 d更換培養(yǎng)液1次，細胞豐度達80%時傳代或用于實驗研究

1.3.3細胞轉染 取對數(shù)生長期的前列腺癌DU145和LNCaP細胞鋪于6孔板中，待生長至70%融合時，更換無血清培養(yǎng)基，隨后進行miR-372 mimics (45 nmol/L)、miR-372 inhibitor (45 nmol/L)及其對應無關對照序列(negative control,NC)的轉染。具體操作步驟按照Lipofectamine TM 2000轉染試劑盒說明進行操作，12 h后更換培養(yǎng)基，24 h后去上清收集細胞進行RNA檢測。

1.3.4qRT-PCR檢測 轉染后DU145和LNCaP細胞中miRNA-372的表達量 細胞樣本采用胰酶消化離心收集后，每組樣本加入2 mL Trizol試劑裂解。按照Trizol法步驟提取各組細胞總RNA，具體操作步驟同(1.3.1)。實驗重復3次。

1.3.5細胞劃痕實驗 轉染完成后取各轉染組對數(shù)生長期的細胞置于24孔板，細胞密度9×104/孔，設3個復孔，細胞呈現(xiàn)單層貼壁生長時，用10 μL的消毒槍頭在24孔板垂直劃痕，并劃好標記。然后用無血清培養(yǎng)基洗3次，換無血清培養(yǎng)基。37 ℃、5%CO2(體積分數(shù))培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。用顯微鏡觀察同一位置不同時間點(0、24 h)劃痕寬度變化情況并拍照，圖片使用IPP軟件分析，使用Image J測量細胞劃痕面積，并計算遷移率。以24 h細胞遷移率計算為標準，遷移率為(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。LNCaP、DU145細胞各實驗重復3次，隨機無序干擾的LNCaP、DU145細胞(NC)作為陰性對照。

2 結 果

2.1 前列腺癌和癌旁組織中miR-372的表達qRT-PCR實驗結果顯示miR-372在64例前列腺癌組織中的表達低于對應的癌旁組織(2.068±0.626vs.7.550±1.951)差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001，圖1)。

2.2 miR-372的表達與前列腺癌臨床病理的關系按照前列腺癌患者年齡、臨床分期、病理評分、是否轉移分組，發(fā)現(xiàn)miR-372的表達在不同患者年齡、Gleason評分、TNM分期和轉移組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

2.3 miR-372的轉染效率使用合成的無序隨機干擾miR-372序列(NC組)、miR-372模擬物(miR-372 mimics 組)、抑制物(miR-372 inhibitor組)轉染前列腺癌LNCaP和DU145細胞組，細胞培養(yǎng)48 h后提取總的RNA，qRT-PCR檢測miR-372的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)：miR-372 mimics能上調前列腺癌細胞中miR-372的表達，而miR-372 inhibitor能顯著抑制前列腺癌細胞中miR-372的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖2)。證明轉染有效，可用于后續(xù)功能實驗。

2.4 miR-372轉染對前列腺癌LNCaP和DU145細胞遷移的影響細胞劃痕結果顯示，LNCaP細胞中，miR-372 NC組在24 h時細胞遷移率為60%，顯著低于inhibitor組的97%(P=0.001)，高于mimics組的25%(P<0.001)；DU145細胞中，miR-372 NC組在24 h時細胞遷移率為64%，顯著低于inhibitor組的96%(P<0.001)，高于mimics組的35%(P<0.001)，說明轉染miR-372后前列腺癌細胞的遷移能力有明顯變化(圖3、4)。

圖2 各轉染組miR-372在前列腺癌細胞中的表達情況

圖3 miR-372各轉染組前列腺癌細胞遷移情況

圖4 細胞遷移率比較的統(tǒng)計曲線

3 討 論

早期診斷和治療可以有效提高腫瘤患者的生存率。目前已經發(fā)現(xiàn)多種腫瘤和組織miRNA的表達譜發(fā)生變化，并且這些miRNA表達的異常改變與腫瘤的浸潤和轉移密切相關[7]。miRNA可以穩(wěn)定存在于血液、血清、尿液中，所以越來越多的研究致力于探討miRNA作為非侵入性生物學標志物檢測腫瘤的可行性。

已有報道顯示miRNA-372在多種腫瘤組織中表達異常。TU等[8]報道m(xù)iR-372表達上調與口腔癌的淋巴結轉移呈正相關。WU等[9]報道在肝癌腫瘤轉移中，miR-372的表達水平顯著降低。miR-372在多種腫瘤組織中的不同表達可能與miR-372對下游不同基因調控水平的差異有關，并且其可能參與了不同的腫瘤分子水平信號通路。本研究發(fā)現(xiàn)miR-372在前列腺癌組織中表達明顯下調，說明其可能為前列腺癌的抑癌因子，分析顯示miR-372的表達水平與前列腺癌的進展密切相關，特別是與前列腺癌轉移關系更為緊密。這與KONG等[10]的報道相似，他們發(fā)現(xiàn)miR-372的低水平表達與淋巴結陽性的前列腺癌關系密切。說明miR-372可能參與了前列腺癌的轉移過程，且有作為前列腺癌預測和診斷的分子標記物的潛力，本研究設計了細胞功能實驗，結果顯示抑制miR-372后，前列腺癌DU145和LNCaP細胞遷移率明顯增強。那么到底miR-372參與調控前列腺癌的分子機制是什么呢？上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細胞失去極性，降低細胞間的粘連能力，獲得組織間質形態(tài)的一個過程，EMT與腫瘤的進展關系目前已經被證實[11]。FAN等[12]發(fā)現(xiàn)miR-372可通過WNT信號途徑，影響肺腺上皮EMT過程從而導致肺癌的進展。KONG等[10]研究顯示miR-372通過核因子-kappa B(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路靶向抑制P65基因，影響前列腺癌細胞的遷移和增殖從而達到抑癌作用。

本研究進一步通過軟件預測發(fā)現(xiàn)miR-372可能對下游多達92個基因具有調控作用，其中鋅指蛋白(zinc finger protein,ZNF)家族較為重要。已知ZNF家族基因編碼蛋白與核酸相互作用，具有多種功能。其具有的鋅指結構域是一個保守的氨基酸序列基序，包含2個特定位置的半胱氨酸和2個參與鋅配位的組氨酸。而且，ZNF家族作為轉錄因子多參與其下游調控，共同促進疾病進展[13]。本研究推測miR-372也可能通過調控ZNF家族進一步影響下游分子水平促進前列腺癌進展。miR-372在前列腺癌組織中低表達，并且這種低表達和前列腺癌的臨床分期、病理分級和是否發(fā)生轉移均有相關性，抑制miR-372的表達可明顯增強前列腺癌細胞的活力，加速其遷移，說明miR-372對前列腺癌具有抑制作用。腫瘤的分子調控是復雜的生物學過程，單一研究并不能解釋清楚機理。對于miR-372而言，其多通路和多分子水平調控才是對前列腺癌影響的關鍵。下一步我們將進行多信號通路、多分子水平的基因調控實驗闡釋miR-372抑制前列腺癌的分子網路機制。