Box-Behnken響應面法優(yōu)選蜜炙金銀花炮制工藝及其藥效學*

張欣榮，李越，許蕊蕊，邱仁杰，齊梵琨，王秀麗

(1.河北省中醫(yī)院藥劑科，石家莊 050011；2.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488；3.南方醫(yī)科大學外國語學院，佛山 528300)

金銀花性寒，味甘，入肺、心、胃經(jīng)，清熱解毒，主治溫病發(fā)熱、熱毒血痢、癰疽疔毒等?，F(xiàn)代研究證明，金銀花含有綠原酸等藥理活性成分，對溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌等多種致病菌及上呼吸道感染致病病毒等有較強的抑制力，另外還可增強免疫力，有抗炎、解熱等作用，其臨床用途非常廣泛，臨床常泡水飲用治療咽炎。其多用生品，而筆者臨床研究發(fā)現(xiàn)蜜制金銀花具有更好的治療咽炎效果。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載：“蜂蜜安五臟之不足，益氣補中，止痛解毒，除百病，和百藥，久服強志輕身，不老延年[1]。”蜂蜜能抗菌消炎、收斂解毒、祛癖止痛，加快炎癥的吸收。眾多研究表明[2-4]，綠原酸為金銀花治療急性咽炎的主要藥理活性成分，因此筆者以綠原酸含量為主要標準，系統(tǒng)篩選金銀花蜜制工藝，并考察其對急性咽炎的治療效果。

1 材料與儀器

1.1材料 金銀花(廣州市嶺南中藥飲片有限公司佛山分公司，批號：1805001)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學王晶娟副教授鑒定，符合2015年版《中華人民共和國藥典》相關項下的要求。蜂蜜(福建新之源生物制品有限公司)。綠原酸對照品(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，含量≥98%，批號：121102)。

1.2儀器 DFT-100A型手提式高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；CP225D 型電子分析天平(Sartorius，感量：0.01 mg)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，300 W，40 kHz)；Waters超高效液相色譜儀(美國Waters公司)，包括二元超高壓溶劑系統(tǒng)、自動進樣恒溫樣本管理器、二極管陣列檢測器、Empower色譜工作站；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；喉頭噴霧器(澳翔醫(yī)械有限公司)；全自動血細胞分析儀(景瑞科技基層醫(yī)療)。

2 方法與結果

2.1單因素實驗

2.1.1加蜜量對綠原酸提取率的影響 稱取金銀花4份，每份100 g，分別在15%，20%，25%，30%的加蜜量下悶潤2 h，將藥材置烘箱內，在150 ℃下，烘制12 min。制備供試品溶液，測定綠原酸含量。綠原酸量隨加蜜量增加而增加，在加蜜量約為20%時達到最大值，繼續(xù)增加綠原酸量反而下降，因此最佳蜜量約為20%。

2.1.2悶潤時間對綠原酸提取率的影響 稱取金銀花3份，每份100 g，在20%的加蜜量下分別悶潤1，2，3 h，將藥材置烘箱內，在150 ℃下，烘制12 min。制備供試品溶液，測定綠原酸含量。綠原酸量隨悶潤時間延長而增加，在悶潤時間約為2 h時達到最大值，繼續(xù)增加綠原酸量反而下降，因此最佳悶潤時間約為2 h。

2.1.3烘制溫度對綠原酸提取率的影響 稱取金銀花4份，每份100 g，在20%的加蜜量下悶潤2 h，將藥材置烘箱內，分別在100，120，150，180 ℃下，烘制12 min。制備供試品溶液，測定綠原酸含量。結果表明，綠原酸量隨烘制溫度升高而升高，在烘制溫度約為150 ℃時達到最大值，繼續(xù)增加綠原酸量反而下降，因此最佳烘制溫度約為150 ℃。

2.1.4烘制時間對綠原酸提取率的影響 稱取金銀花3份，每份100 g，在20%的加蜜量下悶潤2 h，將藥材置烘箱內，在150 ℃下，分別烘制8，12，16 min。制備供試品溶液，測定綠原酸含量。綠原酸量隨烘制時間延長而增加，在烘制時間約為12 min時達到最大值，繼續(xù)增加綠原酸量反而下降，因此最佳烘制時間約為12 min。

2.2Box-Behnken響應面法優(yōu)選炮制工藝

2.2.1實驗設計及結果 通過前期預實驗和單因素實驗的考察結果，本實驗選取因素為加蜜量(A)，烘制溫度(B)，烘制時間(C)和悶潤時間(D)等4個因素設為自變量，以綠原酸含量為評價指標，考察各因素對蜜炙金銀花的影響，每個因素選取低、中、高3個水平，設計因素水平見表1，實驗結果見表2。

表1 設計實驗因素與水平

Tab.1Factorsandlevelsoftheexperiment

水平加蜜量(A)/%炮制溫度(B)/℃炮制時間(C)/h悶潤時間(D)/h-11512081020150122+125180163

2.2.2模型擬合 采用Design-Expert 對上面數(shù)據(jù)進行分析，見表3。以Y對自變量進行模型擬合，并通過相關系數(shù)(R2)等對擬合模型進行評價，通過比較各擬合方程的擬合度，得到二次多項式回歸方程Y=0.56+0.039×B+0.084×C-0.017×D-0.016×A×C-0.015×A×D-0.021×B×C-0.017×C×D-0.025×A2-0.15×B2-0.15×C2，R2=0.940 1，P<0.000 1，F(xiàn)=15.69，表明模型差異有統(tǒng)計學意義；失擬項P=0.126 0，失擬項不顯著，說明該模型擬合度和可信度均有效，實驗誤差小，可以用此模型對蜜制金銀花的制備工藝進行分析和預測。

2.2.3響應面優(yōu)化分析 根據(jù)擬合方程，通過Design-Expert V8.0.6.1版軟件繪制評價指標綠原酸隨因素變化的等高線圖和響應面圖，見圖1～6。

可見，炮制時間對綠原酸含量的提取呈拋物線形，即隨著炮制時間的增長，綠原酸的提取率呈先增大后降低的趨勢，但悶潤時間對于綠原酸含量的提取并不明顯；炮制溫度和炮制時間對綠原酸的提取率的影響均呈拋物線形，即隨炮制溫度和延長炮制時間的同時增大，綠原酸的提取率呈先增大后降低的趨勢，因此在提取工藝中適當提高炮制溫度和炮制時間可以提高綠原酸的提取率。加蜜量對于綠原酸的提取率幾乎沒有影響，但隨著炮制溫度的提高綠原酸的提取率達到最大值，當炮制溫度繼續(xù)升高時，綠原酸含量緩慢降低，因此在實際生產(chǎn)中應將炮制溫度控制在最佳范圍。

2.2.4驗證實驗 根據(jù)回歸模型分析可知，蜜制金銀花的最優(yōu)條件為：20.43%加蜜量，炮制溫度153.98 ℃，炮制13.29 min，悶潤1 h。按照優(yōu)化的處方劑量，考慮實際操作的可行性，各因素值保留為整數(shù)，即20%加蜜量，炮制溫度為154 ℃，炮制13 min，悶潤1 h。制備3 批蜜炙銀花參樣品，測定綠原酸含量分別為0588 6，0.608 1，0.609 9 mg·g-1，RSD=1.96%，與預測值0.606 1 mg·g-1的標準偏差小于5%，說明所得實驗結果重復性好，制備工藝穩(wěn)定。

表2 Box-Behnken響應面法優(yōu)選炮制工藝實驗設計及其結果

Tab.2DesignandresultsoftheoptimizationofprocessingexperimentbyBox-Behnkenresponsesurfacemethod

序號加蜜量(A)/%炮制溫度(B)/℃炮制時間(C)/min悶潤時間(D)/h綠原酸含量/(mg·g-1)1201501220.535 6212151501230.564 8023251201220.309 0144201801620.374 206520150810.351 635620120820.174 0997201801210.462 8128151501210.570 7179201501220.557 83610201501220.588 73811201801230.432 65012151801220.403 14613201201210.355 25914201501220.588 23415151201220.341 96616201501630.424 84717251501230.553 70918201501220.541 07719251501620.455 6762025150820.262 56921251501210.618 89122201201620.368 54623251801220.405 2512415150820.252 94325201201230.355 15426151501620.510 5882720180820.264 0852820150830.333 81329201501610.509 790

2.3藥效學實驗

2.3.1大鼠急性咽炎 ①實驗方法。采用氨水咽部噴霧的方法建立Wistar大鼠的急性咽炎動物模型：固定大鼠，壓舌板壓住大鼠舌頭以暴露咽部，將濃度為15%的氨水用喉頭噴霧器向大鼠咽部噴霧，每次噴3撳，每天上下午各噴1次，連續(xù)噴3 d[5]。

表3 方差分析

圖1 炮制時間-悶潤時間等高線圖

Fig.1Contourplotofprocessingtime-moisteningtime

圖2 炮制時間-悶潤時間響應面圖

Fig.2Responsesurfacediagramofprocessingtime-moisteningtime

圖3 炮制時間-炮制溫度等高線圖

Fig.3Contourplotofprocessingtime-processingtemperature

圖4 炮制時間-炮制溫度響應面圖

Fig.4Responsesurfacediagramofprocessingtime-bakingtemperature

圖5 加蜜量-炮制時間等高線圖

Fig.5Contourplotofhoneycontent-processingtime

圖6 加蜜量-炮制時間響應面圖

Fig.6Responsesurfacediagramofhoneycontent-processingtime

將大鼠隨機分為7組，每組10只，分別為模型對照組、空白對照組、草珊瑚含片組、金銀花蜜炙大劑量組、金銀花蜜炙小劑量組、金銀花大劑量組(未炮制)、金銀花小劑量組(未炮制)。按臨床用藥以人體質量60 kg為標準，參照體表面積劑量換算法計算大鼠給藥劑量。草珊瑚含片組420 mg·kg-1·d-1[6]，蜜制金銀花大劑量組840 mg·kg-1·d-1，蜜制金銀花小劑量組420 mg·kg-1·d-1，金銀花大劑量組840 mg·kg-1·d-1，金銀花小劑量組420 mg·kg-1·d-1，草珊瑚含片用純化水配成溶液，金銀花水提后過濾濃縮，于造模后噴霧給藥，每天上下午各1次，連續(xù)噴霧給藥 4 d。

②檢測指標與結果。動物生存狀態(tài)觀察：實驗期間，每日觀察記錄各組動物外觀狀態(tài)及飲水情況，每日觀察動物咽部情況。造模后，大鼠咽喉部位黏液分泌增多，咽部黏膜充血、腫脹呈鮮紅色等現(xiàn)象，出現(xiàn)咳喘現(xiàn)象，頻頻搔抓口部，跳躍不安，大鼠精神狀態(tài)欠佳、被毛失去光澤[7]。與《中藥新藥治療急性咽炎的臨床研究指導原則》中本病的診斷標準近似，說明急性咽炎模型造模成功。

血常規(guī)檢查：造模結束后第1天，各組自眼內眥取血1 mL，檢測血常規(guī)指標；給藥結束后第1天，各組大鼠依照上述方式采血，檢測血常規(guī)指標。大鼠血常規(guī)檢測結果見表4。

表4 大鼠血常規(guī)檢測結果

Tab.4Resultsofbloodroutineexaminationinrats

組別中性粒細胞淋巴細胞空白對照組3.41±0.075.52±0.06模型對照組2.98±0.13①6.85±0.06①草珊瑚含片組3.32±0.06②5.49±0.09②蜜炙金銀花 大劑量組3.40±0.07②5.57±0.06② 小劑量組3.20±0.06②6.23±0.07②金銀花 大劑量組3.25±0.09②6.16±0.07② 小劑量組3.12±0.10②6.46±0.07②

①與空白對照組比較，t=62.82，42.10，P<0.01；②與模型對照組比較，t=-40.53～3.20，P<0.01。

①Compared with blank control group，t=62.82，42.10，P<0.01；②Compared with model control group，t=-40.53-3.20，P<0.01.

造模后，模型對照組與空白對照組比較，大鼠血液中性粒細胞數(shù)目明顯減少(P<0.01)，淋巴細胞數(shù)目明顯增加(P<0.01)，表明動物模型建造成功。給藥4 d后，與造模不給藥組比較，草珊瑚含片組、蜜炙金銀花大劑量組、蜜炙金銀花小劑量組、金銀花大劑量組、金銀花小劑量組中的中性粒細胞數(shù)量逐漸恢復，且各組中的淋巴細胞數(shù)量有所下降，說明蜜炙金銀花、金銀花和草珊瑚含片草珊瑚含片均對咽炎有一定的治療作用。此外，蜜炙金銀花大劑量組與草珊瑚含片組比較，中性粒細胞數(shù)量恢復更多(t=-2.53，P=0.0241)；而淋巴細胞降低較少(t=-2.14，P=0.0508)，故蜜炙金銀花比草珊瑚含片對急性咽炎的治療作用稍好。

2.3.2小鼠耳廓腫脹炎癥 ①實驗方法。將大鼠隨機分為7組，每組12只，分別為模型對照組、空白對照組、阿司匹林組、蜜炙金銀花大劑量組、蜜炙金銀花小劑量組、金銀花大劑量組(未炮制)、金銀花小劑量組(未炮制)。按臨床用藥以人體質量60 kg為標準，參照體表面積劑量換算法計算小鼠給藥劑量。動物每天灌胃給藥1次，連續(xù)3 d，模型對照組和空白對照組給予等量純化水。末次給藥后30 min，用移液槍吸取二甲苯0.05 mL均勻滴于小鼠右耳前、后面，左耳作為對照。2 h后將小鼠處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑9 mm的打孔器分別在左、右耳同一部位沖下圓耳片，稱質量。以左右耳片質量之差作為腫脹度并計算抑制率，比較組間差異。

抑制率(%)=(模型對照組腫脹度-給藥組腫脹度)/ 模型對照組腫脹度×100%

②實驗結果。與空白對照組比較，模型對照組小鼠耳部的腫脹度明顯(t=6.65，P<0.01)。與模型對照組比較，蜜炙金銀花組和未炮制金銀花組小鼠耳部的腫脹度均顯著降低(t=9.42,P<0.01)，見表5。

表5 金銀花對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

組別腫脹度/mg抑制率/%空白對照組0.84±0.11-模型對照組20.56±3.25①-阿司匹林組9.86±4.36②52蜜炙金銀花 大劑量組10.49±3.78②48 小劑量組12.20±4.58②41金銀花 大劑量組12.35±3.69②39 小劑量組13.86±5.10②32

①與空白對照組比較，P<0.01；②與模型對照組比較，P<0.01。

①Compared with blank control group,P<0.01；②Compared with model control group,P<0.01.

3 討論

與常用的均勻設計、正交設計等比較，Box-Behnken響應面法采用多元線性和二次項模型擬合能提高實驗精確度并預測最佳點。故本實驗采用Box-Behnken響應面法優(yōu)化蜜炙金銀花炮制工藝，同時確定了炮制工藝4個主要影響因素加蜜量、炮制溫度、炮制時間、悶潤時間的具體參數(shù)，對于飲片炮制規(guī)范生產(chǎn)有一定的指導意義。

大鼠急性咽炎藥效實驗中，筆者將中性粒細胞和淋巴細胞作為檢測指標，且已有大量實驗表明這些指標對于咽炎的治療具有參考價值[8-9]。由于氨水刺激造成模型對照組大鼠免疫系統(tǒng)損傷而使得模型對照組中性粒細胞減少，而蜜炙金銀花使其升高，降低其游走、吞噬、消化等功能，因而減弱對炎癥區(qū)的浸潤與吞噬作用[10]。且經(jīng)有效化學刺激產(chǎn)生的炎癥，病理學表現(xiàn)為炎癥細胞浸潤明顯，其中以淋巴細胞等為主[11]。在炎癥反應中，淋巴細胞比例增加，而蜜炙金銀花可以降低全血中淋巴細胞，使炎癥減輕，因此蜜炙金銀花相對于普通金銀花有更好的治療急性咽炎的藥理作用。