熒光互補技術(shù)在活細胞中研究蛋白質(zhì)相互作用的應(yīng)用

王菲

（聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城252000）

蛋白質(zhì)是構(gòu)成組織細胞的基本物質(zhì)，也是機體生長發(fā)育、組織更新等生命活動的承擔(dān)者。生命活動的執(zhí)行并不是基于單一蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)間復(fù)雜的相互作用幾乎介導(dǎo)了所有活細胞中的生命活動。由此可見，研究深入了解PPI 對人類社會的發(fā)展具有深遠的意義。

1 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）

蛋白互作的鑒定及蛋白質(zhì)在代謝中的作用，是蛋白質(zhì)生化的熱門領(lǐng)域。蛋白質(zhì)之間的相互作用是由它們接觸點的互補表面決定的，這種相互作用是折疊過程中所涉及的物理化學(xué)性質(zhì)的結(jié)果，最終形成同源或異源寡聚體。這些結(jié)合位點具有平坦的拓撲結(jié)構(gòu)，接觸界面不均勻，只有少數(shù)殘基提供能量，是它們相互作用親和力的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，PPI 的結(jié)構(gòu)域多態(tài)性較低，特別是與結(jié)合相關(guān)的殘基。涉及PPI 的保守結(jié)構(gòu)域的一個例子是PDZ(PSD-95、Dlg 和ZO-1 蛋白)，從細菌到人類的進化過程中，這個結(jié)構(gòu)域被保存下來。在相互作用過程中，這些結(jié)構(gòu)域與對應(yīng)蛋白的羧基末端殘基相互作用。同樣，結(jié)構(gòu)域也可以單獨與其他結(jié)構(gòu)域(如SH3 一樣)相互作用，形成與信號級聯(lián)有關(guān)的復(fù)合物。每種蛋白質(zhì)都有能力激發(fā)幾種PPI，表明蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)比基因組序列更復(fù)雜，此外，PPI 還具有動態(tài)性，同時性和繼時性。利用熒光互補技術(shù)在活細胞內(nèi)研究PPI 更為研究未知蛋白質(zhì)的功能提供了強有力的工具。

2 BiFC 技術(shù)的起源及理論依據(jù)

2002 年，Hu 等經(jīng)實驗研究第一次提出BiFC 的概念。該實驗采用的熒光蛋白是GFP 的突變子增強型黃色熒光蛋白（EYFP），將1 組相互作用的同向平行的Leu 拉鏈與從多個特定位點切開的EYFP 的碳端和氮端融合表達。結(jié)果表明，在氨基酸Ala154，Asp155 位切開與Leu 拉鏈共表達的融合蛋白，能夠在活體內(nèi)發(fā)出黃色熒光[1]。若沒有融合蛋白間的相互吸引，單個GFP 片段不具熒光活性。用熒光蛋白構(gòu)建BiFC 系統(tǒng)的關(guān)鍵是在熒光蛋白中找到合適的分割位點。通過對照實驗，找出在蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)相互作用恢復(fù)熒光時，能產(chǎn)生最亮的熒光切割處，然后將C 端和N 端與一對互相作用的目標蛋白共表達。當(dāng)目標蛋白對相互作用時，N 和C 片段緊密相連，開始了片段N和C 之間的空間互補過程。因此，熒光蛋白分子被重構(gòu)，最終允許在適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長下發(fā)出熒光，BiFC 技術(shù)由此建立起來。

3 應(yīng)用

3.1 熒光互補技術(shù)在大腸桿菌中的應(yīng)用

BiFC 系統(tǒng)建立后，2004 年，Tsuchisaka 等利用BiFC 技術(shù)研究9 個1- 氨基環(huán)丙烷-1- 羧酸合成酶（ACS）多肽是否可以構(gòu)成異源二聚體，這些多肽由擬南芥基因組編碼。該研究在大腸桿菌體內(nèi)融合表達出不同多肽的y92a 和k278a 突變體，并用這些共表達產(chǎn)物進行分子間互補實驗，實驗數(shù)據(jù)顯示它們可以形成異源二聚體。2007 年，Morell M等研究了蛋白間弱相互作用，采用了BiFC 技術(shù)和流式細胞術(shù)聯(lián)合技術(shù)。該實驗的研究對象是富含Pro 多肽p41 和c-Ab1 Tyr 激酶的一個結(jié)構(gòu)域SH3，將黃色熒光蛋白（YFP）在第155 和156 位氨基酸處切割，分別與上述兩個研究對象構(gòu)建成表達載體p-p41-NYFP 和p-Abl-SH3-CYFP。以單轉(zhuǎn)為對照，兩個表達載體共轉(zhuǎn)BL21（DE3）菌株體內(nèi)。實驗結(jié)果表明，單獨的YFP 片段不具熒光活性，而存在共表達的BL21（DE3）內(nèi)檢測到黃色熒光[2]。

3.2 熒光互補技術(shù)在動物活細胞中的應(yīng)用

雙分子熒光互補在動物細胞內(nèi)研究PPI 得到廣泛應(yīng)用。在細胞內(nèi)蛋白質(zhì)以特定的形式發(fā)揮其生物學(xué)功能。細胞內(nèi)大量的細胞蛋白質(zhì)是寡聚的，研究蛋白質(zhì)寡聚為蛋白質(zhì)功能的研究提供了重要的見解，而BiFC 是實現(xiàn)這一目的有力工具。α- 突觸核蛋白的錯折疊、寡聚和纖維蛋白化是帕金森?。≒D）和其他相關(guān)神經(jīng)疾病發(fā)生和發(fā)展的主要原因。通過在活細胞中應(yīng)用BiFC，發(fā)現(xiàn)α- 核蛋白寡聚體的穩(wěn)定性會增加細胞毒性，Hsp70可以在減少α- 核蛋白寡聚體形成，來減少細胞毒性。BiFC 在神經(jīng)退行性疾病的分子基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用能夠直接顯示活細胞中的α- 核蛋白寡聚體及其Hsp70 對其的調(diào)節(jié)作用，從而成為尋找治療神經(jīng)疾病的新工具。利用熒光互補系統(tǒng)了解寡聚是如何發(fā)生的，對于治療疾病開發(fā)新的治療方法至關(guān)重要。

3.3 熒光互補技術(shù)在植物活細胞中的應(yīng)用

2003 年，Hu 等人提出了多色熒光蛋白互補技術(shù)，該技術(shù)的提出離不開BiFC 的基礎(chǔ)。2004 年，Walter 等構(gòu)建了多種表達載體研究植物蛋白互作[3]，這是首次報道BiFC 技術(shù)應(yīng)用于擬南芥原生質(zhì)體、煙草葉中。這些蛋白互作分析為BiFC 在不同細胞間隔中高效顯示不同結(jié)構(gòu)蛋白的可行性奠定了基礎(chǔ)。經(jīng)過發(fā)展，多個BiFC 系統(tǒng)運用到植物活細胞中，同時顯示同一細胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)相互作用。這種方法是基于不同光譜特征的熒光蛋白片段之間的互補。2008 年，Lee 等人的研究發(fā)現(xiàn)在煙草BY-2 原生質(zhì)體、洋蔥表皮細胞中，農(nóng)桿菌病毒VirE2 與跨膜蛋白-4、擬南芥核轉(zhuǎn)運蛋白都發(fā)生相互作用，不同的是前者互作的場所在細胞核，而后者發(fā)生于細胞質(zhì)中。該結(jié)論的發(fā)現(xiàn)，是研究者利用了多色BiFC 技術(shù)，將Venus 和Cerulean 克隆到CFP 的N 端（nVenus 或nCerulean），靶蛋白克隆到CFP 的C 端，nVenus 和C- 端融合蛋白互作發(fā)出黃色熒光，C- 端融合蛋白和nCerulean作用處則呈現(xiàn)了藍色熒光[4]。由此可見，多色BiFC 是一種有效的技術(shù)，可以同時確定一個給定的“誘餌”蛋白和多個“獵物”蛋白質(zhì)在活的植物細胞中的相互作用。多色熒光蛋白互補技術(shù)在研究植物信號傳導(dǎo)中也發(fā)揮著重要作用，對農(nóng)業(yè)發(fā)展有著極大影響。

4 展望

近些年，BiFC 技術(shù)在PPI 研究中已經(jīng)得到普遍應(yīng)用，且發(fā)展迅速，并從多色熒光互補技術(shù)產(chǎn)生，到與其它技術(shù)如熒光共振能量轉(zhuǎn)移，流式細胞術(shù)的聯(lián)用，使其具有更加廣泛的應(yīng)用前景。