不同冬小麥品種拔節(jié)期抗凍性差異及相關(guān)基因表達(dá)分析

姚永偉，韓巧霞，張奧深，雍曉宇，高宏歡，劉素君，宋天啟，王晨陽(yáng)

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450002)

黃淮海小麥優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)是我國(guó)最大的冬小麥產(chǎn)區(qū)，對(duì)確保我國(guó)的糧食安全具有重大的意義[1]。拔節(jié)期是小麥冬后生長(zhǎng)的高峰期，生長(zhǎng)發(fā)育迅速，對(duì)于水肥要求較高，是決定產(chǎn)量的一個(gè)重要階段[2]。黃淮海地區(qū)時(shí)常出現(xiàn)低溫災(zāi)害天氣，主要分為冬、春季凍害。在春季，小麥進(jìn)入幼穗分化的關(guān)鍵期，對(duì)溫度的變化十分敏感，若此時(shí)突然發(fā)生大幅度的降溫，將嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量，一般減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)幅度達(dá)到50%[3]。幾乎每年的3-4月份，黃淮麥區(qū)都會(huì)出現(xiàn)2～5 d的大幅度降溫天氣，降溫達(dá)6～10 ℃左右，有時(shí)甚至低于0 ℃，嚴(yán)重影響了小麥幼穗的正常發(fā)育，因此對(duì)小麥抗低溫的特性研究十分重要[4-5]。

在同樣發(fā)生倒春寒的地塊，不同品種間受害程度差異顯著。而對(duì)于引起這種差異的原因，主要有兩種觀點(diǎn)：第一種觀點(diǎn)認(rèn)為不同的品種發(fā)育進(jìn)程不一致，生產(chǎn)上所謂的耐倒春寒，很可能是該類(lèi)品種發(fā)育遲緩、拔節(jié)晚而避開(kāi)了倒春寒發(fā)生時(shí)期，其本身并不具備耐倒春寒機(jī)制；第二種觀點(diǎn)認(rèn)為品種間抵御倒春寒的能力在遺傳基礎(chǔ)上存在差異，有些小麥品種在遭受倒春寒的危害后自我恢復(fù)能力很強(qiáng)，小麥的抗凍性在冬季和春季并不是顯著相關(guān)，冬季抗凍力強(qiáng)的小麥品種在春季的抗凍性并不一定強(qiáng)[6]。低溫逆境會(huì)使細(xì)胞發(fā)生一系列生理生化變化，如抗氧化物質(zhì)增加、可溶性糖積累、組織含水量下降、膜流動(dòng)性改變、新蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)合成、多種代謝酶的增加等[7]。本研究選取在河南推廣面積較大且在前期田間調(diào)查中發(fā)現(xiàn)其在春季拔節(jié)期抗凍性存在明顯差異的兩個(gè)冬小麥品種百農(nóng)207和鄭麥366，盆栽種植至拔節(jié)期，通過(guò)人工氣候室模擬低溫處理，測(cè)定其生理指標(biāo)，并通過(guò)熒光定量PCR(qRT-PCR)測(cè)定幾個(gè)抗逆基因的表達(dá)量,分析兩個(gè)小麥品種的抗凍性差異機(jī)理，以期為冬小麥倒春寒抗性鑒定及品種選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

供試小麥材料為河南省推廣面積較大的半冬性小麥品種百農(nóng)207和鄭麥366。試驗(yàn)在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)采用盆栽(26 cm×28 cm)方式進(jìn)行。盆栽用土為大田0～30 cm 耕層壤質(zhì)潮土，有機(jī)質(zhì)含量17.8 g·kg-1，全氮含量0.99 g·kg-1，堿解氮含量57.9 mg·kg-1，速效磷含量67.5 mg·kg-1，速效鉀含量204.8 mg·kg-1，pH值為7.94。測(cè)得田間持水量為 25.91%。每盆裝過(guò)篩土7.5 kg，之后埋于大田，盆內(nèi)土壤表面與盆外大田保持齊平。3葉期定苗，每盆15株，澆水量根據(jù)土壤墑情決定，每個(gè)盆栽保持一致。

小麥植株發(fā)育至拔節(jié)期(藥隔形成初期)時(shí)在人工氣候室內(nèi)-5 ℃低溫連續(xù)處理24 h，在低溫處理0 h、6 h和24 h時(shí)取主莖最上部全展葉用于生理指標(biāo)測(cè)定及基因表達(dá)分析。

1.2 儀器與試劑

定量?jī)x器為QuantStudio 5 Real-Time PCR System, Thermo Fisher Scientific，RNA提取試劑盒RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)和熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqⅡ均購(gòu)自寶生物有限公司。

1.3 生理指標(biāo)的測(cè)定

小麥葉片中MDA含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法，脯氨酸含量測(cè)定采用茚三酮顯色法，均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)[8]。

1.4 基因表達(dá)分析

1.4.1 小麥葉片總RNA提取與cDNA第一鏈的合成

取小麥葉片0.1 g，用RNA提取試劑盒提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄體系和條件：第一步，總RNA 2.0 μL ,Oligo dT Primer(50 μM) 1 μL,DEPC 9.5 μL,反應(yīng)條件42 ℃，2 min；第二步，第一步反應(yīng)混合液 12.5 μL，5×PrimeScript II Buffer 4.0 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，PrimeScript II RTase 1.0 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，反應(yīng)條件37 ℃，15 min，85 ℃，5 s獲得cDNA。

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以小麥Actin基因作為內(nèi)參基因，通過(guò)NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索逆境相關(guān)基因序列，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，由河南尚亞生物技術(shù)有限公司合成(表1)。定量PCR體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5 μL，上游引物 0.75 μL，下游引物 0.75 μL，cDNA 2 μL,ddH2O補(bǔ)足20 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ for 30 s,變性95 ℃ for 5 s，退火/延伸60 ℃ for 45 s，40個(gè)循環(huán)。采取2-△△Ct法計(jì)算待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息

1.5 低溫脅迫后幼穗受凍情況調(diào)查

低溫脅迫處理后，將處理后的盆栽小麥放置在自然條件下自然恢復(fù)生長(zhǎng)15 d后，調(diào)查幼穗的受凍死亡情況，按盆栽數(shù)量逐盆多次統(tǒng)計(jì)分析，取平均值，計(jì)算死亡率。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Excel 2007和SPSS 22軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 拔節(jié)期低溫脅迫后小麥葉片丙二醛(MDA)含量的變化

由圖1可見(jiàn)，低溫處理(處理0 h)前兩個(gè)品種的MDA含量差異不顯著；低溫處理6 h時(shí)百農(nóng)207的MDA含量較低溫處理前略降，鄭麥366的MDA含量則顯著升高。隨著低溫脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，低溫處理達(dá)到24 h時(shí)，兩個(gè)小麥品種的MDA含量均較之前顯著下降，且百農(nóng)207的MDA含量顯著低于鄭麥366，說(shuō)明此時(shí)百農(nóng)207膜脂過(guò)氧化程度輕于鄭麥366。

圖柱上的字母不同表示處理間差異顯著。下圖同。

2.2 拔節(jié)期低溫脅迫后小麥葉片游離脯氨酸(Pro)含量的變化

從圖2可以看出，百農(nóng)207和鄭麥366葉片游離Pro含量分別在在低溫6和24 h時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)下降，整個(gè)試驗(yàn)期間兩個(gè)品種的游離Pro平均含量分別為95.09和66.15 μg·g-1。三個(gè)測(cè)定時(shí)間點(diǎn)百農(nóng)207葉片的Pro含量均顯著高于鄭麥366。

圖2 不同時(shí)間低溫處理下小麥葉片的脯氨酸含量

2.3 拔節(jié)期低溫脅迫后小麥抗逆相關(guān)基因表達(dá)的變化

在低溫處理過(guò)程中，百農(nóng)207葉片中SOD、POD、WCS120、P5CS、LEA相對(duì)表達(dá)量(圖3A-E)均較低溫處理前顯著增加；而鄭麥366在低溫處理6 h時(shí)SOD的表達(dá)量(圖3A)較低溫處理前無(wú)顯著變化，其余基因表達(dá)量均顯著下降。在低溫處理24 h時(shí)，百農(nóng)207的SOD基因表達(dá)量較低溫處理6 h時(shí)顯著下降，POD表達(dá)量變化不顯著(圖3B)，WCS120、P5CS、LEA表達(dá)量(圖3C、D、E)都較低溫處理6 h時(shí)顯著升高，在低溫處理24 h時(shí)這5個(gè)基因的表達(dá)量都較低溫處理前顯著升高。鄭麥366在低溫處理24 h時(shí)SOD、P5CS、LEA、POD表達(dá)量都較低溫處理6 h時(shí)顯著下降，WCS120無(wú)顯著變化，5個(gè)基因的表達(dá)量在低溫處理24 h時(shí)都較低溫處理前均顯著下降。百農(nóng)207的5個(gè)基因表達(dá)量在低溫處理前都顯著低于鄭麥366。百農(nóng)207葉片中SOD在低溫處理24 h時(shí)與鄭麥366表達(dá)量無(wú)顯著差異，其余基因均顯著高于鄭麥366。

圖3 不同時(shí)間低溫處理下小麥葉片抗逆相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量

2.4 小麥拔節(jié)期低溫處理后幼穗受凍情況

調(diào)查結(jié)果表明，-5 ℃低溫脅迫24 h后，百農(nóng)207和鄭麥366的幼穗受凍率分別達(dá)到 72.30%和90.62%，說(shuō)明拔節(jié)期百農(nóng)207的抗凍性強(qiáng)于鄭麥366。

3 討 論

在低溫脅迫條件下，植物的膜透性增加，引起內(nèi)溶物外滲，導(dǎo)致植物代謝的無(wú)序紊亂。植株遭受?chē)?yán)重凍害時(shí)，細(xì)胞會(huì)滲出更多的內(nèi)溶物，植物抗寒性越強(qiáng)，細(xì)胞膜受到的傷害越小[9]。MDA是膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，逆境脅迫下植物中MDA含量越高，說(shuō)明細(xì)胞膜受損越嚴(yán)重[10-11]。劉艷陽(yáng)等[12]研究認(rèn)為，凍害程度低的小麥株系中MDA含量較低,膜質(zhì)過(guò)氧化程度小, 抗寒性強(qiáng)；凍害程度高的株系中MDA含量較高, 膜質(zhì)過(guò)氧化程度高, 抗寒性弱。因此，MDA含量可作為小麥抗寒性鑒定的指標(biāo)。脯氨酸被認(rèn)為是一種植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，也是蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑和羥基自由基清除劑，通過(guò)與磷脂相互作用可以穩(wěn)定細(xì)胞膜，并可作為碳和氮的來(lái)源[13]。游離脯氨酸也是一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以減輕植物在低溫脅迫下造成的機(jī)械損傷，增加細(xì)胞的保水性[14-15]。低溫處理下小麥葉片的脯氨酸含量增加，且小麥抗寒性隨脯氨酸含量的增加而增強(qiáng)[16]。不同小麥品種抗凍性的差異與其在遭受低溫脅迫后相關(guān)生理生化反應(yīng)差異有關(guān)[17]。本研究結(jié)果表明，連續(xù)低溫處理24 h時(shí), 百農(nóng)207的MDA含量顯著低于鄭麥366，而Pro含量顯著高于鄭麥366；低溫脅迫后幼穗受凍率與生理指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果一致，反映出兩個(gè)品種抗凍性存在差異，百農(nóng)207抗凍性高于鄭麥366。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對(duì)植物抗逆性機(jī)制的研究重點(diǎn)從生理水平轉(zhuǎn)向分子水平，并分離出許多抗逆基因，如抗?jié)B透脅迫相關(guān)基因、抗氧化酶基因、抗膜脂相改變的基因、冷誘導(dǎo)基因等[18]。在前期研究中，我們分離出了凍脅迫相關(guān)免受脅迫傷害的功能蛋白抗逆基因如SOD、POD、LEA、P5CS和WCS，其中SOD、POD基因分別控制超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)的合成。WCS120基因是由低溫特異誘導(dǎo)的，編碼一種被認(rèn)為在小麥冷馴化過(guò)程中起重要作用的蛋白質(zhì)[19]。WCS120高表達(dá)可以減輕凍害帶來(lái)的機(jī)械損傷，可維持或提高代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高植物的抗凍性[20]。胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA)[21]氨基酸殘基多以無(wú)規(guī)則卷曲的形式存在, 這種結(jié)構(gòu)有利于與水分子結(jié)合, 維持植物體所需的最低含水量?！?-pyrroline-5-carboxylate synthetase(P5CS)參與RNA剪接、脯氨酸生物合成、脫水反應(yīng)、葉片形態(tài)發(fā)生和負(fù)調(diào)控根的生長(zhǎng)[22]。P5CS是脯氨酸合成途徑中一個(gè)關(guān)鍵基因，催化脯氨酸生物合成的最初前兩步[23]。P5CS表達(dá)與脯氨酸積累密切相關(guān)[24-25]。P5CS過(guò)表達(dá)會(huì)使脯氨酸含量增加，提高轉(zhuǎn)基因馬鈴薯、水稻和小麥的抗逆性[26]。本研究表明，不同小麥品種間葉片中相關(guān)抗逆基因的表達(dá)模式不同，在低溫處理24 h時(shí)百農(nóng)207這5個(gè)基因的表達(dá)量都較低溫處理前顯著升高，而鄭麥366則顯著下降。百農(nóng)207葉片中除SOD在低溫處理24 h時(shí)與鄭麥366表達(dá)量無(wú)顯著差異外，其余四個(gè)基因均顯著高于鄭麥366，這與百農(nóng)207的MDA含量顯著低于鄭麥366的結(jié)果相一致，可見(jiàn)低溫條件下，百農(nóng)207清除活性氧的能力顯著高于鄭麥366，膜質(zhì)過(guò)氧化程度較低, 抗寒性較強(qiáng)。低溫處理后百農(nóng)207葉片中P5CS基因表達(dá)量顯著增加，在低溫處理24 h時(shí)顯著高于鄭麥366，而鄭麥366的表達(dá)量較處理前顯著下降，與其脯氨酸含量表現(xiàn)相一致。據(jù)報(bào)道，脯氨酸的積累是由脯氨酸的生物合成和降解的基因轉(zhuǎn)錄變化所調(diào)控的[27]。Verslues和Sharma[28]也提出了在鹽脅迫條件下擬南芥脯氨酸積累符合PDH和P5CDH下調(diào)、P5CS上調(diào)的代謝模型，本研究結(jié)果與此相似，由于本研究只分析了P5CS表達(dá)量變化，因而低溫條件下冬小麥脯氨酸積累是否與其他基因相關(guān)有待于進(jìn)一步探討。

在低溫脅迫后，生理指標(biāo)和相關(guān)抗逆基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果與低溫脅迫后幼穗受凍率檢測(cè)結(jié)果均表明百農(nóng)207拔節(jié)期抗凍性比鄭麥366高。本課題組近三年大田調(diào)查亦發(fā)現(xiàn)百農(nóng)207的抗凍性總體高于鄭麥366，與本研究結(jié)果相一致。因此在大田栽培過(guò)程中為避免突然發(fā)生的低溫脅迫對(duì)小麥造成的危害，應(yīng)選育和種植抗凍性強(qiáng)的品種。我們下一步主要進(jìn)行相關(guān)抗凍基因特性及功能研究，并有望獲得凍脅迫基因超表達(dá)的小麥植株新品系。