張鈺皎,胡煒東,黃海英,趙雪平,孫子羽,滿都拉,陳忠軍,*
(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特010018;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭014109)
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)和沙門氏菌(Salmonella)是重要的食源性病原菌,其引起的食物中毒是最常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病之一[1]。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌適應(yīng)性極強(qiáng),在各種不利環(huán)境中通常以生物被膜的形式生存[2]。細(xì)菌生物被膜(biofilm)是嵌入胞外多糖中的有組織的微生物聚集體,微生物附著于物體表面后,通過(guò)相互作用釋放胞外多糖將自身包裹其中而形成生物被膜[3]。食源性病原菌在形成生物被膜后對(duì)外界不良環(huán)境抵抗力增強(qiáng),極難被抗生素等殺菌劑清除[4]。食源性病原菌生物被膜會(huì)對(duì)食品加工器具設(shè)備、加工廠地板和墻壁表面造成持續(xù)性污染,一旦清除不完全將會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題,并造成因食品腐敗而引起的經(jīng)濟(jì)損失[5]。
生物被膜的形成過(guò)程中受到多種營(yíng)養(yǎng)因素的調(diào)控,比如載體、生長(zhǎng)溫度、時(shí)間、pH 值、培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)、碳源、氮源和活菌數(shù)等極大影響著生物被膜的形成量和黏附率[6]。鄧開(kāi)野等[5]發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌(S.aureus)生物被膜受到溫度、pH 值、初始菌濃度的影響。Rode等[8]發(fā)現(xiàn)溫度、氯化鈉、葡萄糖和乙醇的聯(lián)合作用可促進(jìn)金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。食品加工環(huán)境的不同,形成食源性病原菌生物被膜的結(jié)構(gòu)也會(huì)不同。目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要致力于研究單一菌種生物被膜的形成條件,對(duì)混合菌生物被膜研究鮮少。因此,探究培養(yǎng)條件對(duì)混合菌生物被膜形成的影響至關(guān)重要。
本文以96 孔聚苯乙烯培養(yǎng)板為載體,經(jīng)結(jié)晶紫染色法染色后,通過(guò)測(cè)定其黏附率,探究培養(yǎng)基pH 值、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌形成的混合菌生物被膜的影響,并采用響應(yīng)面法優(yōu)化最佳培養(yǎng)條件。根據(jù)文獻(xiàn)資料獲得3株單一菌的最佳培養(yǎng)條件[9-11],在最佳形成條件下探究胰蛋白胨大豆肉湯(tryptone soy broth,TSB)培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)和葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌及其混合菌形成的生物被膜的影響。揭示培養(yǎng)條件對(duì)單一菌和混合菌生物被膜的影響規(guī)律,為今后探究食源性病原菌生物被膜生理生化特性和控制食品加工環(huán)境中生物被膜的形成提供理論依據(jù)。
1.1.1 菌株
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC 26003-3、大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC 11775-3、沙門氏菌(Salmonella)ATCC 14028:中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。
1.1.2 試劑
磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉:天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心;結(jié)晶紫、氯化鈉、氯化鉀:鴻之惠商貿(mào)有限公司;草酸銨、甲醇、冰醋酸、乙醇:上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上所用試劑均為分析純。
1.1.3 培養(yǎng)基
胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基:北京陸橋生物技術(shù)有限公司。
Synergy H1 全功能微孔板檢測(cè)儀:美國(guó)伯騰儀器有限公司;SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái):上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;GHP 隔水式恒溫培養(yǎng)箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司;LDZX 全自動(dòng)高壓滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠;浦春JY 系列電子天平:上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司;XH-C 漩渦混勻器:常州未來(lái)儀器制造有限公司;PHS-3 型pH 計(jì):上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。
1.3.1 菌懸液的制備
將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌活化后,分別接種于 TSB 培養(yǎng)基,于 37 ℃、120 r/min 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。將菌懸液稀釋至OD600nm約為0.1,備用[12]。
1.3.2 單一菌和混合菌生物被膜的培養(yǎng)
將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌以1%的接種量分別接種于事先裝有200 μL TSB 培養(yǎng)基的96 孔微量板中,37 ℃下培養(yǎng)24 h 后,微孔板檢測(cè)儀測(cè)其630 nm 下的光密度值A(chǔ)1,空白對(duì)照記為A1C??瞻讓?duì)照組只加TSB 培養(yǎng)基,且試驗(yàn)組及對(duì)照組均進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)。將3 株單一菌懸液以體積比1 ∶1 ∶1 混合后,以1%的接種量接種于每孔添加了200 μL TSB 培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)96 孔板中。在最適條件下培養(yǎng)后,用微孔板檢測(cè)儀測(cè)定630 nm 下的光密度值,處理方法同單一菌[13]。
1.3.3 生物被膜黏附率的測(cè)定
棄去96 孔板中的培養(yǎng)基后,每空加入300 μL 磷酸鹽緩沖液沖洗3 次;然后于每孔中添加200 μL 無(wú)水甲醇固定15 min 后棄去懸浮液,并于60 ℃下干燥1 h;隨后添加200 μL 2 %結(jié)晶紫染液染色20 min,蒸餾水沖洗孔壁至沖洗液無(wú)色,干燥;最后于每孔中添加300 μL 33%冰醋酸,放置10 min;微孔板檢測(cè)儀震蕩 10 min 后測(cè)定 A2和 A2c[14]。黏附率(B 值)的計(jì)算公式為:
式中:A1、A2為培養(yǎng)和染色后的光密度值;A1c、A2c為空白對(duì)照的光密度值。
1.3.4 混合菌生物被膜最佳形成條件的確定
1.3.4.1 培養(yǎng)基pH 值、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)混合菌生物被膜黏附率的影響
分別配制 pH 值為 5、6、7、8、9 的 TSB 培養(yǎng)基,滅菌[15]。每孔中分別加入200 μL 上述培養(yǎng)基,混合菌接種后于37 ℃下靜置培養(yǎng)24 h?;旌暇じ铰实臋z測(cè)如上所述,平行試驗(yàn)3 次。以混合菌生物被膜的黏附率確定最佳培養(yǎng)基pH 值。用此方法依次確定混合菌生物被膜的最佳培養(yǎng)溫度(25、30、37、40、45 ℃)和培養(yǎng)時(shí)間(12、24、36、48、60 h)[16]。
1.3.4.2 通過(guò)響應(yīng)面分析確定混合菌生物被膜最佳培養(yǎng)條件
依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,對(duì)培養(yǎng)基pH 值、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間3 個(gè)影響因素進(jìn)行響應(yīng)面分析。使用Design Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)模型,獲取最佳培養(yǎng)條件參數(shù)。
1.3.5 不同營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)生物被膜黏附率的影響
1.3.5.1 培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)生物被膜黏附率的影響
分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%、6.4%的TSB 培養(yǎng)基,滅菌。每孔中分別加入200 μL 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的TSB 培養(yǎng)基,單一菌和混合菌分別在最適條件下培養(yǎng)[17]。參照1.3.3 測(cè)定單一菌和混合菌生物被膜的黏附率,進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)。
1.3.5.2 NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)生物被膜黏附率的影響
分別配制含NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的 TSB 培養(yǎng)基,滅菌后于每孔中加入200 μL 含不同NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的TSB培養(yǎng)基,單一菌和混合菌生物被膜的培養(yǎng)方法及黏附率的檢測(cè)方法如1.3.2 和1.3.3 所述,平行試驗(yàn)3 次[18]。
1.3.5.3 葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)混合菌生物被膜黏附率的影響
分別配制含葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的 TSB 培養(yǎng)基,滅菌后于每孔中加入200 μL 含不同葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的TSB 培養(yǎng)基,單一菌和混合菌生物被膜的培養(yǎng)方法及黏附率的檢測(cè)方法同1.3.2 和1.3.3,平行試驗(yàn)3 次[19]。
1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
利用Microsoft Excel 2016 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖處理,Design Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面模型。
2.1.1 不同培養(yǎng)基pH 值、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)混合菌生物被膜黏附率的影響
將不同條件下形成的混合菌生物被膜結(jié)晶紫染色法染色后,對(duì)混合菌生物被膜黏附率(B 值)進(jìn)行測(cè)定,確定最佳培養(yǎng)基pH 值、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間,結(jié)果如圖1 所示。
圖1 培養(yǎng)基pH 值、溫度和時(shí)間對(duì)混合菌生物被膜黏附率的影響Fig.1 Effect of medium pH value,temperature,time on the adhesion rate of mixed biofilm
由圖1 可知,混合菌生物被膜的黏附率隨著培養(yǎng)基pH 值的變化呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢(shì),并于pH 7時(shí)達(dá)到最大黏附率0.036 4。馬燕等[20]研究蜂房哈夫尼亞菌生物被膜時(shí)發(fā)現(xiàn),中性培養(yǎng)條件更利于其生物被膜的形成。因此,在混合菌生物被膜培養(yǎng)中應(yīng)選用此培養(yǎng)基pH 值,過(guò)酸或過(guò)堿的培養(yǎng)基都會(huì)抑制混合菌生物被膜的形成?;旌暇锉荒さ酿じ铰孰S著培養(yǎng)溫度的增加也呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢(shì),在37 ℃時(shí)的混合菌黏附率高達(dá)0.035 1。低于37 ℃時(shí),由于溫度過(guò)低,生物被膜形成緩慢,導(dǎo)致黏附能力較弱。而超過(guò)37 ℃后,黏附率明顯下降,說(shuō)明過(guò)高的溫度會(huì)減弱生物被膜的形成能力。郝旭昇等[21]探究了不同生長(zhǎng)溫度(12、25、37 ℃)對(duì)阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29004 生物被膜形成的影響,發(fā)現(xiàn)25 ℃和37 ℃下阪崎克羅諾腸桿菌的黏附菌量和生物被膜形成量高于12 ℃,但是阪崎克羅諾腸桿菌在37 ℃形成了更加致密且立體的生物被膜結(jié)構(gòu)。綜合考慮,混合菌生物被膜的最佳培養(yǎng)溫度為37 ℃。不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)B 值的影響顯著,培養(yǎng)24 h時(shí)所得的混合菌黏附率明顯高于其他組分,因此選用24 h 為最佳培養(yǎng)時(shí)間。
2.1.2 響應(yīng)面法優(yōu)化混合菌生物被膜的形成條件
依據(jù)單因素試驗(yàn)分析結(jié)果,以黏附率(Y)為響應(yīng)值,采用Design Expert 8.0.6 設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken 試驗(yàn)。響應(yīng)面模型因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。
表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and their levels of response surface design
表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and corresponding experimental data
應(yīng)用回歸分析對(duì)方程和方程的各因子進(jìn)行方差分析,分析結(jié)果如表3 所示。
從表3 中可以看出,該模型極其顯著(P<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),模型的決定系數(shù) R2=0.985 3,因此可選用該方程代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)響應(yīng)值有效預(yù)測(cè)和分析。培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度對(duì)混合菌生物被膜的形成影響極顯著(P<0.01),二次項(xiàng) A2、B2和 C2極顯著(P<0.01),交叉項(xiàng) AB、BC 極顯著(P<0.01),其它均不顯著。各因素對(duì)混合菌生物被膜黏附率的影響程度順序?yàn)锳>B>C,即培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時(shí)間>培養(yǎng)基pH 值。
將某因素固定在中心值不變,分析另外兩個(gè)因素的交互作用對(duì)混合菌生物被膜黏附率的影響結(jié)果,如圖2 所示。
圖2 兩因素及其交互作用響應(yīng)面圖Fig.2 Surface plot and contour for reciprocal effection of three operating parameters
比較圖2 曲面圖和等高線可以看出,培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)混合菌生物被膜的黏附率影響顯著,表現(xiàn)為曲面較陡。而培養(yǎng)基pH 值對(duì)于黏附率影響不顯著,培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的交互作用極顯著。各因素之間兩兩交互作用對(duì)混合菌生物被膜黏附率的影響強(qiáng)度由強(qiáng)到弱依次為:AB>BC>AC,與方差分析結(jié)果一致?;貧w方程求解的最佳培養(yǎng)條件經(jīng)驗(yàn)證為:培養(yǎng)溫度36.2 ℃,培養(yǎng)時(shí)間21.3 h,培養(yǎng)基pH 7.12,此條件下混合菌生物被膜的黏附率可達(dá)0.032 4。為實(shí)際操作方便,將理論混合菌生物被膜形成條件調(diào)整為培養(yǎng)溫度為36 ℃,培養(yǎng)時(shí)間為22 h,培養(yǎng)基pH 值為7。
2.2.1 培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)生物被膜黏附率的影響
培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)生物被膜黏附率的影響見(jiàn)圖3。
圖3 培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)生物被膜黏附率的影響Fig.3 Effect of medium quality score on the adhesion rate of biofilm
微生物生物被膜的形成過(guò)程中,營(yíng)養(yǎng)條件是影響其黏附率的最大因素之一。TSB 培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不同,使其為微生物的黏附提供的營(yíng)養(yǎng)不同,造成微生物生物被膜黏附率的波動(dòng)。由圖3 可知,大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和混合菌生物被膜的黏附率隨著培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。且當(dāng)TSB 培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.6%時(shí),形成的生物被膜黏附率最大,即大腸桿菌黏附率為0.065 2,沙門氏菌為0.030 2,金黃色葡萄球菌為0.083 2 和混合菌為0.035。單一菌和混合菌的黏附率在TSB 培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.2%時(shí)呈明顯下降趨勢(shì),因?yàn)槲⑸镌跔I(yíng)養(yǎng)脅迫環(huán)境下傾向于形成生物被膜,以保護(hù)自身不被外界不利條件所影響。研究發(fā)現(xiàn)混合菌生物被膜的黏附率低于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌單獨(dú)形成生物被膜的黏附率。這表明混合菌生物被膜中的菌株間互相存在著競(jìng)爭(zhēng)作用,這種競(jìng)爭(zhēng)作用的存在會(huì)使得自然條件下形成的混合菌生物被膜的黏附率有所降低。
2.2.2 NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)生物被膜黏附率的影響
NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)3 株單一菌及其混合菌生物被膜黏附率的影響見(jiàn)圖4。
圖4 NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)生物被膜黏附率的影響Fig.4 Effect of NaCl quality score on the adhesion rate ofbiofilm
從圖4 可以看出,單一菌和混合菌生物被膜的黏附率隨著NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加逐漸降低。剛添加0.2%的NaCl 時(shí),4 種生物被膜的形成都已受到抑制。當(dāng)NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%時(shí),金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌單獨(dú)形成的生物被膜明顯被抑制,即下降率為大腸桿菌0.026,金黃色葡萄球菌0.042,沙門氏菌0.012。但混合菌生物被膜的總體下降率明顯低于3 株單一菌的下降率,說(shuō)明混合菌生物被膜對(duì)NaCl 的敏感性較弱。根據(jù)文獻(xiàn)[22]可知,混合菌生物被膜中菌株的相互競(jìng)爭(zhēng)作用雖導(dǎo)致黏附率降低,但是由于不同微生物分泌的胞外物質(zhì)不同,增加了混合菌生物被膜的復(fù)雜性使得混合菌生物被膜對(duì)外界的抵抗力較強(qiáng)。高濃度的NaCl 產(chǎn)生的滲透壓可使細(xì)胞脫水直至死亡[23]。因此,NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高,微生物生物被膜的黏附率越低??赏茰y(cè)一定濃度的NaCl 可以有效抑制微生物形成生物被膜,為食品加工中有效控制生物被膜的生長(zhǎng)提供依據(jù)。
2.2.3 葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)生物被膜黏附率的影響
葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)生物被膜黏附率的影響見(jiàn)圖5。
圖5 葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)生物被膜黏附率的影響Fig.5 Effect of glucose quality score on the adhesion rate of biofilm
微生物生物被膜中的主要成分是多糖,糖源是調(diào)控微生物形成生物被膜的主要因素之一。靳嘉巍等[24]研究表明,碳源直接決定了微生物形成生物被膜的能力,且含糖量高的微生物形成生物被膜的能力愈高。由圖5 可知,單一菌和混合菌在含葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%~0.8%的TSB 培養(yǎng)基中的黏附率是逐漸上升的,說(shuō)明葡萄糖可增強(qiáng)單一菌和混合菌生物被膜的形成能力。且大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和混合菌的黏附率于葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%時(shí)達(dá)到最大,即大腸桿菌黏附率為0.079,沙門氏菌為0.029 8,金黃色葡萄球菌為0.096 6 和混合菌為0.042 2。葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%~1.4%間黏附率雖有所下降,但仍可促進(jìn)細(xì)菌黏附作用。因此可知,一定濃度的碳源可有效促進(jìn)微生物形成生物被膜,且混合菌生物被膜對(duì)葡萄糖較單一菌生物被膜敏感性強(qiáng),在葡萄糖僅為0.2%時(shí)黏附率已高達(dá)0.038 2,且基本維持穩(wěn)定。因此在食品加工過(guò)程中,應(yīng)多次清洗食品加工器具及設(shè)備,盡可能降低食品加工過(guò)程中的糖分殘留量,以避免微生物形成生物被膜而造成食品安全隱患。
以96 孔微量板作為單一菌和混合菌生物被膜的黏附載體,通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化了培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)基pH 值對(duì)食源性病原菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌形成的混合菌生物被膜的最佳形成條件。結(jié)果表明,混合菌生物被膜的最佳培養(yǎng)溫度為36 ℃,最佳培養(yǎng)時(shí)間為22 h,最適培養(yǎng)基pH 值為7。在此最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)一步研究營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)單一菌和混合菌生物被膜形成能力的影響,研究發(fā)現(xiàn)TSB 培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)和葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和混合菌生物被膜的形成能力有顯著影響。其中TSB 培養(yǎng)基質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.6 %時(shí)形成的生物被膜黏附率最大;碳源加強(qiáng)了單一菌和混合菌生物被膜的黏附率,因此在高糖類食品生產(chǎn)中應(yīng)格外注意病原菌生物被膜的形成;而當(dāng)NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.4%時(shí),對(duì)食源性病原菌生物被膜的形成有一定的抑制作用,因此在食品加工中可以通過(guò)添加NaCl,并結(jié)合其它抑菌方法來(lái)抑制清除食源性病原菌形成的生物被膜。