人參糖肽研究進展

俞 萍張慶賀,2陳長寶趙明月戰(zhàn) 宇杜連云

(1. 長春中醫(yī)藥大學吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130117；2. 長春中醫(yī)藥大學藥學院，吉林 長春 130117)

人參為五加科植物人參(PanaxginsengC. A. Mey.)的干燥根和根莖。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》等古籍記載，人參自古就被作為食品與藥物來服用[1]，2012年衛(wèi)生部將其正式列入藥食同源中藥[2]。人參性甘、微苦，微溫，具有大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智等功效，主要用于治療體虛欲脫、脾虛食少、肺虛喘咳、津傷口渴、氣血虧虛、驚悸失眠、免疫力低下、糖尿病等癥狀[3-4]。其所含的化學成分主要有皂苷、多糖、多肽、蛋白質(zhì)、糖肽、聚炔醇、揮發(fā)油、氨基酸、有機酸類等[5-7]，其中人參皂苷、多糖、多肽以及糖肽等為生物活性成分。近年來，肽類成分因其分子量小于蛋白質(zhì)而具有較高的生物利用度，又因其多具有獨特的生物活性備受關注[8]，被廣泛應用于藥品、食品、保健食品及化妝品等領域。

文章擬綜述人參糖肽的制備方法、分離純化技術、檢測分析方法、臨床應用及藥理活性等內(nèi)容，并展望其未來發(fā)展方向，旨在為人參糖肽的進一步研究提供依據(jù)。

1 簡介

糖蛋白是由Montreuil于1973年提出，是除核酸外，由蛋白質(zhì)分子與一種或多種含有碳水化合物基團的物質(zhì)組成的復合物[9-10]。糖肽(glycopeptides)是指糖蛋白和蛋白聚糖中，糖與氨基酸或多肽鏈以共價鍵相連而形成的區(qū)域[11]，且糖肽在食品中常用于制作酒類，如張奎昌等[12-13]發(fā)明了一種銀杏糖肽酒的生產(chǎn)方法和一種富含大蒜糖肽的大蒜保健酒及其加工方法。人參糖肽(ginseng glycopeptides，GGP)相對分子質(zhì)量為200～50 000 Da，其糖部分主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、巖藻糖、N-乙酰葡萄糖胺與N-乙酰半乳糖胺組成；其肽部分主要由17種氨基酸組成，包括甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等[14-15]；具有降血糖、降血脂、降膽固醇、增強學習記憶能力、保護神經(jīng)細胞、抗炎鎮(zhèn)痛等功能活性[14，16-17]。

2 提取與分離

2.1 提取

糖肽類成分的提取方法主要包括水提醇沉法、醇提水沉法以及透析法等。楊明等[18]采用分級沉淀法得到人參糖肽粗提物后，將其用蒸餾水溶解，于0～3 ℃冰箱中冷凍放置24 h，過濾，除去不溶物，濾液中加入粉末活性碳脫色，攪拌，靜置，濾去雜質(zhì)，濃縮干燥，即可得到白色或微黃色精制的人參糖肽。王穎等[19-20]先采用透析法得到制備低相對分子質(zhì)量人參糖肽的工藝，而后通過響應面法篩選制備低分子質(zhì)量人參糖肽的最佳透析工藝：超濾液透析前其配制質(zhì)量濃度為0.6 g/mL，透析時間為301.8 min，透析外液用水量為3.92 L，此條件下總糖肽量為人參水提物的79.26%。羅浩銘等[21]通過醇提水沉與超濾法相結合，將超濾后的分離液濃縮并凍干，得到收率為原藥材7%的人參非皂苷部分，再采用先煎煮后過D101大孔吸附樹脂洗脫、超濾、透析法得到人參糖蛋白[22]，其收率為人參藥材的0.45%。綜上，水醇法是人參糖肽的主要提取方法，為得到小分子人參糖肽，常與透析法聯(lián)合應用，該方法提取工藝簡單、經(jīng)濟、安全，適用于工業(yè)化大生產(chǎn)，尤其適用于食品或保健食品的開發(fā)。但其提取效果并不理想，采用新方法、新手段以提高人參糖肽提取率的最佳提取工藝仍有待進一步研究。

2.2 分離

南敏倫等[23]使用DEAE-Sepharose CL-6B離子交換柱分離人參糖肽，并依次用0.2，0.5，1.0 mol/L的NaCl水溶液洗脫，再用Sephadex G-150、G-100柱分離純化，采用0.2 mol/L的NaCl水溶液洗脫可得到PGP-II，且PGP-II為主要的降血脂活性組分，其相對分子質(zhì)量為6 000，其中糖部分由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖及葡萄糖4種單糖構成，物質(zhì)的量為n(Rha)∶n(Ara)∶n(Gal)∶n(G1c)=0.46∶1.61∶1.00∶2.37。楊明等[18]使用Sephadex G-100凝膠層析、醋酸纖維薄膜電泳、Con-A-Sepharose 4B、親和層析證明了PGP-II為均一糖肽而不是糖和肽的混合物；甲基化分析表明，其糖肽中單糖的連接方式主要是(1→4)Glc、(1→4)、(1→6)Gal，(1→4或5)Ara，Ara和Glc為主要末端，Glc的6位，Gal的4或6位，Gal的(1→4)應該為分枝點；氨基酸分析表明，PGP-II肽部分由天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Fhr)、谷氨酸(Ser)、甘氨酸(Glu)等16種氨基酸組成。人參糖肽類成分由于其結構中糖和氨基酸的個數(shù)與種類不同，導致其化合物的分子量有較大差別，因此其分離手段主要是根據(jù)化合物的分子量不同而采用凝膠柱層析法，該方法具有操作簡便，分離效果較好，重復性高等特點。有關人參糖肽的分離純化的研究較少，且其分離純化方法的研究不夠深入全面，還有待改善。

3 檢測與分析

3.1 含量檢測

人參糖肽含量檢測主要是以其中性糖、酸性糖及蛋白質(zhì)含量為指標。苯酚—硫酸法常被用來測定中性糖含量[24-25]，以葡萄糖為標準品；間羥基聯(lián)苯法常被用來測定酸性糖含量[26-27]，以半乳糖醛酸為標準品；Lowry法常被用來測定蛋白含量[28-29]，多以牛血清蛋白為標準品。

3.2 分子量分布測定

人參糖肽分子量測定常采用高效液相色譜法，該方法操作簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，分離度高，對質(zhì)量控制具有重要意義。王穎等[30]使用高效液相凝膠色譜分析系統(tǒng)，以葡聚糖Dextran T系列為標準品制作標準曲線，利用GPC軟件計算人參糖肽PG-g分子量分布；其選用OHpakSB-802(8.0 mm×300 mm)凝膠分析柱，以0.7% Na2SO4為流動相，柱溫35 ℃，流速0.5 mL/min，此時人參糖肽PG-g是分子量為1 305 Da和581 Da左右的兩種糖肽的混合物。王穎等[31]采用高效液相色譜法(HPLC)，以L-色氨酸、蛋白酶抑制劑、VB12、細胞色素C和牛血清白蛋白為對照品制作標準曲線，以pH 7.0的磷酸鹽緩沖液為流動相，柱溫為室溫，流速0.5 mL/min，進樣量20 μL條件下，人參糖蛋白顯示出多個峰，其分子量分布為1～40 kU，平均分子量為17 731 U。羅浩銘等[21]運用HPLC，以相對分子質(zhì)量為1 000，3 000，5 000，12 000，25 000的葡聚糖與葡萄糖標準品制作標準曲線，選用Sepax SRT SEC-100(Φ7.8 mm×300 mm，5 μm)色譜柱，柱溫35 ℃，以pH 7.0的磷酸鹽緩沖液為流動相，流速0.5 mL/min，測得人參非皂苷分子量為200～50 000 Da。

4 結構鑒定

4.1 糖類型

羅浩銘等[22]通過HPLC法分析人參糖蛋白組成糖，將樣品制備成PMP衍生物，以PMP衍生物的各單糖為對照品，選用Diamonsil-C18分析柱(Φ4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，以流動相A為磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)與乙腈體積比85∶15、流動相B為磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)與乙腈體積比60∶40，流速0.9 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長250 nm，進樣量10 μL，得到的人參糖蛋白組成糖主要含有甘露糖(Man)、半乳糖(GalA)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰葡萄糖或N-乙酰半乳糖(GlcNAc或GalNAc)。

4.2 糖結構

王穎等[30]通過將人參糖肽PG-g制備成甲基化衍生物，將甲基化產(chǎn)物加入氫化鋁鋰的四氫呋喃溶液中，80 ℃反應16 h，然后加入稀鹽酸至無氣泡產(chǎn)生，離心取上層，吹干后二次甲基化，經(jīng)水解、還原和乙?；⑦M行GC-MS分離鑒定，結果顯示GlcA和GalA為PG-g的非還原末端，其中以GlcA為非還原末端的較多，以(1→3)-連接的GalA和(1→6)-連接的GlcA為主鏈，(1→3)-連接的GalA含量高于(1→6)-連接的GlcA，同時在部分GlcA的C3位與少量GalA的C6位存在分支點，而Ara以(1→2，4)-連接方式存在于主鏈與支鏈中。

4.3 氨基酸種類

王穎等[31]將20 mg人參糖蛋白加至6 mol/L HCl中，并充入氮氣封口，于110 ℃烘箱內(nèi)水解22 h，冷卻，搖勻，過濾，雙蒸水定容至50 mL，取1 mL凍干后加入0.02 mol/L HC1搖勻，14 000 r/min離心15 min，吸取0.8 mL 上清液過0.45 μm濾膜，選用9 Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm)色譜柱，柱溫為室溫，以乙腈—水(55∶45，體積比)∶KH2PO4緩沖液(pH 7.2)=30∶70(體積比)為流動相，通過紫外檢測器檢測，檢測波長254 nm，流速1 mL/min，結果顯示，其肽部分主要由甘氨酸、半胱氨酸與蘇氨酸等17種氨基酸組成。

5 功能活性

5.1 降血糖

人參糖肽在臨床使用中可明顯降低2型糖尿(T2DM)患者的血糖，雖起效比較緩慢，但效果持久，即使停止服用后，血糖在一段時間內(nèi)仍處于一個較低的水平[32]。人參糖肽注射液已作為國家級治療糖尿病(DM)的中藥二類新藥[33]應用于臨床，其對體外糖基化有明顯抑制作用，可用于消渴病、慢性并發(fā)癥的預防和治療，且具有補氣、生津和止渴的功效[34]，并能增加機體免疫力和修復胰島的功能[35]。Wang等[36]闡明了人參糖肽的降血糖機制，人參糖肽為β-受體激動劑，通過第二信使cAMP將信息傳輸至線粒體和細胞質(zhì)，線粒體CST、MDH、SDH和CCO活性增加，導致糖有氧氧化過程改進和血糖水平下降，降低的血糖由PP活性升高導致的加速肝糖元分解來補充。劉雪梅等[37]通過建立2型糖尿病大鼠模型，采用高脂飼料喂養(yǎng)4周后再腹腔注射STZ的研究方法，表明STZ糖尿病小鼠受人參糖肽的影響血糖明顯下降，糖脂代謝得到改善，抑制胰島素抵抗和多種并發(fā)癥，人參糖肽結合耐力運動對STZ糖尿病大鼠的效果優(yōu)于純?nèi)藚⑻请暮湍土\動。陳文學等[17]建立了2型糖尿病氣陰兩虛模型，將過量的青皮和附子顆粒通過灌胃給予糖尿病大鼠，結果顯示人參糖肽可使糖尿病氣陰兩虛大鼠血糖水平顯著下降。趙麗艷等[38-39]通過免疫組化法證實了人參糖肽對STZ引起的大鼠體外胰島β細胞損傷有防護作用。綜上，目前對人參糖肽的降血糖機制與作用研究比較深入，其良好的降血糖作用為糖尿病的治療提供了新思路和新方向。

5.2 降血脂作用

劉雪梅等[40]通過建立高脂血癥大鼠模型的方法研究了人參糖肽的降血脂作用，結果表明，耐力運動組、純注射人參糖肽組與人參糖肽結合耐力運動組大鼠的TG、TC、LDL-C、ApoB、MDA顯著低于高脂模型對照組，而HDL-C、ApoA1、SOD水平顯著偏高；與耐力運動組相比，純注射人參糖肽組TC水平顯著偏低，SOD水平顯著偏高，而其他指標無明顯變化，人參糖肽結合耐力運動組TG、TC、LDL-C、ApoB及MDA水平顯著偏低，HDL-C、SOD和GSH水平顯著偏高；與純注射人參糖肽組相比，人參糖肽結合耐力運動組TG、LDL-C、ApoB及MDA水平顯著偏低，SOD、GSH顯著偏高，而其他指標無明顯變化；純注射人參糖肽和單純耐力運動可降低大鼠血脂水平，具有良好調(diào)節(jié)機體脂質(zhì)代謝紊亂的作用；人參糖肽結合耐力運動對高脂血癥大鼠的降脂作用效果優(yōu)于單純給予人參糖肽與單純耐力運動。上述結果表明，人參糖肽降血脂作用的研究不夠深入全面，且其作用機制均未見報道，后續(xù)可在相關方面進行深入研究。

5.3 抗炎和鎮(zhèn)痛作用

田建明等[41]采用角叉菜膠及甲醛誘發(fā)大鼠炎癥疼痛模型的研究方法，發(fā)現(xiàn)人參糖肽具有抗炎和鎮(zhèn)痛效果；當角叉菜膠致炎后6 h，15，30，60 mg/kg的人參糖肽具有明顯降低大鼠足腫脹度、炎癥足組織丙二醛的效果；30，60 mg/kg 的人參糖肽具有明顯降低該模型大鼠血清IL-1，IL-2，IL-4，TNF-α，組胺的效果；人參糖肽對甲醛致痛Ⅰ相(1～5 min)疼痛評分值基本無影響；15，30，60 mg/kg 的人參糖肽對疼痛模型大鼠腦組織5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素、谷氨酸和γ-氨基丁酸等基本無影響，但其具有顯著抑制Ⅱ相(31～35 min)疼痛評分值的效果。說明人參糖肽雖具抗炎和鎮(zhèn)痛效果，但其具體作用機制依舊不詳，還有待進一步研究。

5.4 神經(jīng)細胞保護作用

胡婧婷等[14]通過Aβ25-35處理的PC12細胞凋亡模型的方法，研究人參糖肽對神經(jīng)細胞的作用；當在PC12細胞中加入人參糖肽后，細胞存活率明顯提高，凋亡率與S期細胞百分比顯著降低；當人參糖肽濃度為1 g/L時，細胞存活率最高可達121.07%，最低為108.61%。說明人參糖肽可減慢凋亡速度，具有神經(jīng)細胞保護作用，但其作用機制還有待考究。

5.5 其他作用

人參糖肽除了具有降血糖、降血脂、抗炎鎮(zhèn)痛、保護神經(jīng)細胞的功能活性外，還具有增強學習記憶能力[21]、抗凋亡[42]、改善膠原交聯(lián)[43]等藥理作用。Li等[43]通過觀察人參糖肽對大鼠尾腱膠原交聯(lián)體內(nèi)外的影響情況，發(fā)現(xiàn)尾腱膠原在人參糖肽的影響下，其溶解性明顯增加。

6 結束語

目前，人參糖肽的研究主要集中于提取、分離、含量測定和功能活性等方面，但其提取方法較為單一、提取率低，且有關其分離純化的研究相對很少，尤其是工業(yè)化的提取和純化；由于人參糖肽結構的復雜性，其高級結構的鑒定研究有待提高；生物活性方面，其毒理學及臨床試驗也需逐漸開展，以及人參糖肽的構效關系研究也需進一步開展。