白酒糟復合裂殖壺藻粉發(fā)酵生產飼料蛋白

李悅明，李 霞，徐洪清2，徐建春，逄瑞蓮3，張云鵬，徐炳政

(1.青島瑯琊臺集團股份有限公司，山東 青島 266400；2.青島西海岸新區(qū)農業(yè)農村局，山東 青島 266400；3.青島西海岸新區(qū)市場監(jiān)督管理局，山東 青島 266400)

白酒糟是白酒生產過程中產生的廢渣或副產物，其處理利用已經成為行業(yè)工作的重點。據統(tǒng)計，我國酒糟年產2 700萬噸，如果處理不及時，便會造成環(huán)境污染[1-2]，白酒糟中含有一定量的蛋白質、還原糖、維生素及淀粉等成分，如能加以利用，則是一種很好的原料[3-4]。裂殖壺藻是一種單細胞海洋真菌[5]，裂殖壺藻粉是裂殖壺藻經噴霧干燥后的一種餌料資源，其細胞內含有大量的有活性物質，如油脂DHA、蛋白等，保證飼料中DHA含量可以提高水產動物的忍耐力，提高存活率促進其生長發(fā)育，改善免疫作用[6-8]。兩者都是優(yōu)良的飼料原料，但是蛋白質量分數相對偏低，本試驗通過混合兩種發(fā)酵原料，經微生物作用后，提高原料的蛋白質質量分數，同時改變傳統(tǒng)酒糟發(fā)酵無DHA的特點，改善飼料產品品質。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑曲霉菌種、產朊假絲酵母菌種(實驗室保存)、白酒糟、裂殖壺藻粉，青島瑯琊臺集團；自動定氮儀KDN-103F，上海纖檢儀器有限公司；電子天平CP213，奧豪斯儀器有限公司。

1.2 粗蛋白的測定

利用自動定氮儀KDN-103F，采用凱氏定氮法，測定粗蛋白含量[9]。

1.3 硝酸銨的定性檢測

加6～8滴上清液到點滴板上，然后加2～3滴二苯胺，觀察顏色變化結果，陽性反應的結果：在點滴板中間是深藍色，最低檢測線是0.05%[10]。

1.4 微生物混合原料發(fā)酵試驗

將白酒糟烘干粉碎后和裂殖壺藻粉按m(白酒糟)∶m(裂殖壺藻)=1∶1.5混合后制備發(fā)酵原料，將此原料進行不同的發(fā)酵條件的蛋白質量分數實驗。

1.4.1 微生物不同混合比實驗

在其他發(fā)酵條件相同的條件下，將黑曲霉和產朊假絲酵母分別按m(黑曲霉)∶m(產朊假絲酵母)=0.6∶1，0.8∶1，1∶1，1∶1.2的比例在添加總量相同的條件下測定產物粗蛋白質量分數。

1.4.2 微生物接種量試驗

在其他發(fā)酵條件相同的條件下，分別按接種量2%，3%，4%，5%，6%的比例添加混合菌種測定產物粗蛋白質量分數。

1.4.3 硝酸銨添加量試驗

在其他發(fā)酵條件相同的條件下，將硝酸銨分別按質量分數0.05%，0.1%，0.15%，0.2%，0.25%添加到發(fā)酵原料中后測定產物粗蛋白質量分數。

1.4.4 培養(yǎng)基水分試驗

在其他發(fā)酵條件相同的條件下，將水分質量分數分別調整到34%，36%，38%，40%，42%，測定產物粗蛋白質量分數。

1.4.5 pH試驗

在其他發(fā)酵條件相同的條件下，將pH分別調整到4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，測定產物粗蛋白質量分數。

1.4.6 麩皮添加量試驗

在其他發(fā)酵條件相同的條件下，將麩皮分別按質量比5%，10%，15%，20%，25%的比例添加到發(fā)酵原料中發(fā)酵后測定產物粗蛋白質量分數。

1.4.7 溫度作用試驗

在其他發(fā)酵條件相同的條件下，將混合好的發(fā)酵原料分別在26，28，30，32，34 ℃發(fā)酵后測定粗蛋白質量分數。

1.4.8 發(fā)酵作用時間實驗

在其他發(fā)酵條件相同的條件下，分別控制發(fā)酵時間在48，60，72，84 h測定發(fā)酵蛋白質量分數。

1.4.9 最優(yōu)條件發(fā)酵實驗

取上述單因素實驗的最優(yōu)條件，進行發(fā)酵實驗，對比發(fā)酵前后粗蛋白質量分數變化。

2 結果分析

2.1 微生物質量比對粗蛋白質量分數的影響

菌種質量比對粗蛋白質量分數的影響如圖1所示。

圖1 菌種質量比對粗蛋白質量分數的影響Fig.1 Effect of strain ration on the crude protein mass fraction

由圖1可知：不同的菌種比例對粗蛋白的影響較大，原因與黑曲霉和產朊假絲酵母所分泌的酶系或菌體本身的蛋白有關，黑曲霉能分泌蛋白酶和纖維素酶，產朊假絲酵母含有較高的蛋白[11]，菌種之間進行合理配比能夠提高發(fā)酵原料的蛋白質量分數，兩者按1∶1進行配比發(fā)酵粗蛋白質量分數最高。

2.2 接種量對粗蛋白質量分數的影響

接種量對粗蛋白質量分數的影響如圖2所示。

圖2 接種量對粗蛋白質量分數的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on crude protein mass fraction

由圖2可知：當接種量在5%時，發(fā)酵產品的粗蛋白質量分數最高，過低菌株增長緩慢，周期長，過高則使菌種生長過快，不利于粗蛋白積累，而且菌種的制備也較繁瑣，增加接種量會造成成本增加，因此本實驗的接種量控制在5%。

2.3 硝酸銨添加量對粗蛋白的影響

硝酸銨添加量對粗蛋白質量分數的影響如圖3所示。

圖3 硝酸銨添加量對粗蛋白質量分數的影響Fig.3 Effect of ammonium nitrate on the crude protein mass fraction

由圖3可知：隨著硝酸銨用量的添加，粗蛋白呈遞增趨勢，但是在硝酸銨添加量在2%時，經硝酸鹽定性檢測，在點滴板中間已開始出現(xiàn)藍色顏色反應，代表硝酸銨添加過量，而當硝酸銨添加質量分數在1.5%時，粗蛋白質量分數與2%時差別不大，且經硝酸銨定性檢測，無顏色反應，因此選擇硝酸銨添加量為1.5%。

2.4 培養(yǎng)基水分對粗蛋白質量分數的影響

水分質量分數對粗蛋白質量分數的影響如圖4所示。

圖4 水分質量分數對粗蛋白質量分數的影響Fig.4 Effect of water content on the crude protein mass fraction

由圖4可知：控制培養(yǎng)基含水量在42%時，粗蛋白質量分數最高。在培養(yǎng)基含水量較低時，不適宜菌體生長，粗蛋白質量分數較低。當培養(yǎng)基水分質量分數較高時，整個發(fā)酵基質呈現(xiàn)黏著狀態(tài)，阻礙菌體的生長。控制培養(yǎng)基水分對微生物來說是至關重要的，本實驗選擇水分質量分數控制在42%。

2.5 pH對粗蛋白質量分數的影響

pH對粗蛋白的影響如圖5所示。

圖5 pH值對粗蛋白質量分數的影響Fig.5 Effect of pH on the crude protein mass fraction

由圖5可知：發(fā)酵培養(yǎng)基pH在6.0～6.5時，粗蛋白質量分數較高。菌種生長都有最適合的pH，而且隨著發(fā)酵的進行，體系的pH值會發(fā)生變化，因此需要調整培養(yǎng)基的pH，使菌體達到較為適宜的發(fā)酵。

2.6 麩皮添加量對粗蛋白質量分數的影響

麩皮添加質量分數對粗蛋白質量分數的影響如圖6所示。

圖6 麩皮添加量對粗蛋白質量分數的影響Fig.6 Effect of bran amount on the crude protein mass fraction

由圖6可知：麩皮添加質量分數在15%時，原料發(fā)酵后粗蛋白質量分數最高，麩皮含量過高或過低都會影響發(fā)酵產物中粗蛋白的質量分數，這是因為麩皮中含有較多的碳源能促進微生物的生長，同時適量的麩皮的添加可以改善白酒糟的通氣性以保障微生物生長所需要的氧氣[12-13]，但是過量的麩皮會抑制微生物的生長，所以選擇麩皮質量分數為15%時對發(fā)酵蛋白質的提高效果最明顯。

2.7 溫度對粗蛋白質量分數的影響

溫度對粗蛋白質量分數的影響如圖7所示。

圖7 溫度對粗蛋白質量分數的影響Fig.7 Effect of temperature on the crude protein mass fraction

由圖7可知：在30 ℃條件下，粗蛋白質量分數最高。當發(fā)酵溫度較低時，微生物沒有達到最適合的生長條件，生長遲緩，而當發(fā)酵溫度過高時，則可能導致微生物死亡或者微生物生長過快，到達峰值后迅速進入衰亡，因此粗蛋白質量分數較低。

2.8 發(fā)酵時間對粗蛋白質量分數的影響

發(fā)酵時間對粗蛋白質量分數的影響如圖8所示。

圖8 發(fā)酵時間對粗蛋白質量分數的影響Fig.8 Effect of fermentation time on the crude protein mass fraction

由圖8可知：隨著發(fā)酵時間延長，粗蛋白質量分數逐漸提高。在前期菌種需要一定的生長停滯期，在72 h隨著菌絲生長及各種酶質量分數達到最高，蛋白質量分數達到最高，時間再延長，粗蛋白質量分數已提高不大，因此選擇發(fā)酵時間72 h 。

2.9 最優(yōu)條件下粗蛋白質量分數變化

發(fā)酵前后粗蛋白質量分數分別為21.46%和27.63%。在控制以上單因素最優(yōu)條件下進行發(fā)酵，此時微生物生長繁殖最為旺盛，代謝產物積累量最大，原料的粗蛋白質量分數提高最多。

3 結 論

經黑曲霉和產朊假絲酵母發(fā)酵白酒糟和裂殖壺藻粉后可以改善產品質量。發(fā)酵控制條件為在白酒糟和裂殖壺藻粉按m(白酒糟)∶m(裂殖壺藻)=1∶1.5混合后，微生物按m(黑曲霉)∶m(產朊假絲酵母)=1∶1，接種量5%，硝酸銨添加質量分數1.5%，水分質量分數42%，pH 6.0～6.5，30 ℃，麩皮添加質量分數15%，發(fā)酵時間72 h的條件下組合進行發(fā)酵實驗，此時粗蛋白提高率為28.75%。