分光光度法估算經(jīng)皮內(nèi)窺鏡下腰椎椎間盤(pán)切除術(shù)中出血量

夏 宇，晏錚劍，高 翔，王可然，杜 宇，唐鍇鷹，張 汛，陳 亮

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，重慶 400010

經(jīng)皮內(nèi)窺鏡下腰椎椎間盤(pán)切除術(shù)（PELD）作為治療腰椎椎間盤(pán)突出癥（LDH）的一種新興技術(shù)，具有創(chuàng)傷小、對(duì)脊柱穩(wěn)定性影響小、患者術(shù)后恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)［1-4］，但由于PELD在水介質(zhì)中進(jìn)行，術(shù)中持續(xù)沖洗導(dǎo)致術(shù)中出血被大量稀釋?zhuān)袩o(wú)法準(zhǔn)確估算術(shù)中出血量。分光光度法是以氰化高鐵血紅蛋白測(cè)定為基礎(chǔ)，通過(guò)測(cè)定其光密度（OD）值來(lái)計(jì)算血紅蛋白濃度，是國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（ICSH）推薦使用的血紅蛋白測(cè)定方法，對(duì)于低濃度的血紅蛋白亦可準(zhǔn)確測(cè)定，目前測(cè)定血紅蛋白濃度所使用的其他方法均需用此法驗(yàn)證及校準(zhǔn)［5］。本研究采用分光光度法測(cè)量術(shù)中沖洗液的OD值，以氰化高鐵血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，據(jù)此計(jì)算術(shù)中出血量［6］，為PELD術(shù)中出血量的估算提供一種相對(duì)準(zhǔn)確的方法。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2018年3月—10月，本院采用PELD治療LDH患者62例（排除中途轉(zhuǎn)開(kāi)放手術(shù)、術(shù)中沖洗液未完全收集、有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病、手術(shù)前后資料缺如的患者），手術(shù)均由同一組醫(yī)師完成，其中男28例、女34例，年齡（51±13）歲。分別使用分光光度法、血紅蛋白計(jì)算法、目測(cè)法估算術(shù)中出血量。記錄患者術(shù)前和術(shù)后血紅蛋白濃度、術(shù)中沖洗液體積等數(shù)據(jù)。

1.2 方法

1.2.1 分光光度法原理

血紅蛋白中的亞鐵離子（Fe2+）被高鐵氰化鉀氧化為高鐵離子（Fe3+），血紅蛋白轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白（Hi）。Hi與氰化鉀中的氰離子反應(yīng)生成氰化高鐵血紅蛋白（HiCN）。HiCN最大吸收波峰為540 nm，波谷為504 nm［7］。在特定條件下，HiCN在540 nm處的OD值與濃度成正比［8-9］，根據(jù)測(cè)得的OD值可求得血紅蛋白濃度［10-11］。

本研究使用的HiCN標(biāo)準(zhǔn)液（上海榕柏生物科技有限公司）有4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度，分別為50、100、150、200 g/L，使用UV6100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）測(cè)定HiCN標(biāo)準(zhǔn)液在540 nm處的OD值，以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖1a）。由于預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)標(biāo)本中血紅蛋白濃度范圍為1.0 ～ 6.0 g/L，故將100 g/L的標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 g/L的標(biāo)本，測(cè)量其在540 nm處的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，所得曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系良好（圖1b）。將圖1a與圖1b合并，得到合并后標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖1c）作為本研究的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。使用臨床輸血用懸浮紅細(xì)胞驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在本研究中的可行性，選取10份懸浮紅細(xì)胞標(biāo)本，測(cè)定血紅蛋白濃度，分別取5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mL，稀釋至2 000 mL，測(cè)定其OD值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中相應(yīng)濃度對(duì)應(yīng)的OD值比較，驗(yàn)證分光光度法的可行性。

圖1 分光光度法估算出血量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig. 1 Standard curve of spectrophotometry in estimating blood loss

1.2.2 標(biāo)本處理及出血量估算

分光光度法：術(shù)前抽取患者靜脈血5 mL備用。術(shù)前吸引器瓶中預(yù)先加入肝素抗凝，術(shù)中使用一次性防水單及產(chǎn)科剖宮產(chǎn)用防水貼膜，防止沖洗液漏至無(wú)菌單或臺(tái)下。術(shù)中使用的所有沾血紗布均用生理鹽水反復(fù)沖洗至基本無(wú)色。使用吸引器確保收集術(shù)區(qū)所有沖洗液及血液，術(shù)后將沖洗液標(biāo)本充分混勻，采用臨床用一次性輸血器過(guò)濾（紅細(xì)胞平均直徑7 μm，濾網(wǎng)孔徑170 μm）［12-13］，在保證濾除椎間盤(pán)纖維組織、脂肪、韌帶組織等雜質(zhì)的同時(shí)保證血紅蛋白的完整性。取沖洗液標(biāo)本，使用血紅蛋白測(cè)定試劑盒HiCN法處理后測(cè)定其在540 nm處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)出沖洗液中血紅蛋白濃度，同時(shí)測(cè)定患者術(shù)前靜脈血中血紅蛋白濃度，計(jì)算出血量。出血量（mL）=沖洗液標(biāo)本血紅蛋白濃度（g/L）×沖洗液總體積（mL）/術(shù)前血紅蛋白濃度（g/L）。

血紅蛋白計(jì)算法：術(shù)前、術(shù)后均抽取患者靜脈血5 mL，送血常規(guī)檢查，以血紅蛋白每下降5 g/L為失血200 mL［14］，通過(guò)術(shù)前與術(shù)后血常規(guī)中血紅蛋白的濃度差得出術(shù)中出血量。

目測(cè)法：術(shù)后憑主刀醫(yī)師及另外2名有多次此類(lèi)手術(shù)經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師通過(guò)肉眼觀察術(shù)中沖洗液顏色估計(jì)出血量，取3人估計(jì)出血量的平均值作為目測(cè)法結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

以生理鹽水稀釋后的不同濃度懸浮紅細(xì)胞標(biāo)本作為檢測(cè)對(duì)象，測(cè)定的OD值與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中相應(yīng)濃度對(duì)應(yīng)的OD值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可用于低濃度血紅蛋白測(cè)定，分光光度法用于測(cè)定沖洗液中血紅蛋白濃度是準(zhǔn)確可行的。

患者術(shù)前血紅蛋白濃度為（127.0±18.3）g/L，術(shù)后血紅蛋白濃度為（121.9±17.8）g/L，術(shù)中沖洗液量為（1 704±388）mL。分光光度法測(cè)得沖洗液中血紅蛋白濃度為（3.93±1.92）g/L，據(jù)此估算術(shù)中出血量為12.30 ～ 164.33（51.85±27.48）mL ；血紅蛋白計(jì)算法估算的術(shù)中出血量為40 ～ 960（216.00±155.91）mL；目測(cè)法估計(jì)的術(shù)中出血量為5 ～ 100（32.17±20.11）mL；3種方法測(cè)得術(shù)中出血量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），其中目測(cè)法估計(jì)的出血量低于分光光度法，血紅蛋白計(jì)算法估算的出血量高于分光光度法。

3 討 論

術(shù)中出血量是衡量手術(shù)效果的一項(xiàng)重要指標(biāo)，但目前尚缺乏測(cè)量PELD術(shù)中出血量的詳細(xì)方法。在既往文獻(xiàn)中，常規(guī)開(kāi)放手術(shù)術(shù)中出血量的評(píng)估方法是計(jì)算術(shù)前與術(shù)后血紅蛋白的差值，此法簡(jiǎn)便易行，但影響因素過(guò)多（術(shù)中補(bǔ)液、機(jī)體應(yīng)激、術(shù)中麻醉藥物的使用、術(shù)后體液再分布等）［15-16］，精確度偏低，應(yīng)用于出血量較大的傳統(tǒng)開(kāi)放手術(shù)時(shí)誤差尚可接受，而PELD的微創(chuàng)特性，術(shù)中出血對(duì)血紅蛋白水平的影響并不十分明顯，此法并不適用。此外，PELD術(shù)中出血量小且被沖洗液大量稀釋?zhuān)y以直接收集血液進(jìn)行計(jì)算，加之沖洗液中血紅蛋白濃度極低，超出了臨床檢驗(yàn)常用的血細(xì)胞分析儀的最低檢出限度，無(wú)法使用血細(xì)胞分析儀直接測(cè)算［17］。目前，對(duì)于PELD術(shù)中出血量主要依靠主刀醫(yī)師根據(jù)沖洗液的顏色進(jìn)行估算，這種目測(cè)法估計(jì)出血量主要依賴(lài)于主刀醫(yī)師的個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，誤差很大，實(shí)際出血量常比目測(cè)法測(cè)得量高［18］，且各醫(yī)師由于經(jīng)驗(yàn)及認(rèn)知水平不同，對(duì)沖洗液顏色及其相對(duì)應(yīng)出血量的判斷不盡相同，在臨床工作中很難形成量化的標(biāo)準(zhǔn)。

本研究采用分光光度法，以HiCN法為基礎(chǔ)，將術(shù)中收集的所有含有血液的沖洗液均勻混合后作為標(biāo)本，可準(zhǔn)確測(cè)得標(biāo)本中血紅蛋白濃度，進(jìn)一步計(jì)算得到出血量，可提高估算的準(zhǔn)確性。為保證將誤差控制在可接受范圍內(nèi)，本研究采取了一系列措施：①為避免儀器本身的測(cè)量誤差，每次測(cè)定OD值前均使用符合ICSH標(biāo)準(zhǔn)的HICN標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行儀器校正。②由于術(shù)中各階段出血量不同，術(shù)中必須全程收集并使血液與沖洗液均勻混合以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。故本研究術(shù)中使用產(chǎn)科剖宮產(chǎn)用手術(shù)貼膜及一次性防水單，以保證術(shù)中標(biāo)本不會(huì)漏至無(wú)菌單上或手術(shù)臺(tái)下，同時(shí)使用沖洗液將術(shù)中沾血的紗布洗滌至無(wú)色以保證術(shù)中出血盡可能被完全收集。③標(biāo)本凝固將使測(cè)量產(chǎn)生明顯誤差，本研究組在吸引器瓶中預(yù)先使用肝素，可有效防止凝血。④本方法的原理是測(cè)量標(biāo)本的OD值，術(shù)中產(chǎn)生的雜質(zhì)如椎間盤(pán)、脂肪、韌帶等組織將使測(cè)得的OD值偏大，使用臨床用一次性輸血器過(guò)濾沖洗液可有效避免雜質(zhì)對(duì)標(biāo)本OD值的影響，同時(shí)可保證紅細(xì)胞完全通過(guò)輸血器濾網(wǎng)（紅細(xì)胞平均直徑為7 μm，濾網(wǎng)孔徑為170 μm）。為保證估算的準(zhǔn)確性，本研究操作較為繁瑣，今后仍需進(jìn)一步探討更簡(jiǎn)便且嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆椒ㄒ匝杆俟浪鉖ELD術(shù)中出血量，并確保進(jìn)一步減少實(shí)驗(yàn)誤差。

本研究驗(yàn)證了分光光度法計(jì)算PELD術(shù)中出血量的可行性，且此方法并不局限于這一手術(shù)方式，還可用于估算其他以水為介質(zhì)的微創(chuàng)手術(shù)術(shù)中出血量，如膀胱鏡、各種關(guān)節(jié)鏡、頸椎經(jīng)椎間孔入路內(nèi)窺鏡技術(shù)、經(jīng)皮腎鏡等。準(zhǔn)確估算術(shù)中出血量是評(píng)價(jià)手術(shù)創(chuàng)傷大小、比較不同術(shù)式療效差異、指導(dǎo)術(shù)后康復(fù)治療的重要指標(biāo)，分光光度法可較為準(zhǔn)確地估算PELD術(shù)中出血量，為臨床工作中評(píng)估出血量提供了一個(gè)量化標(biāo)準(zhǔn)和新的選擇。