二甲雙胍通過(guò)PI3K-AKT-MDm2通路對(duì)PCOS患者子宮內(nèi)膜的影響

邵 洋，楊婷婷，張 潔，強(qiáng) 萍

0 引言

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡婦女月經(jīng)紊亂和不孕的最常見(jiàn)病因，臨床表現(xiàn)為持續(xù)無(wú)排卵、雄激素過(guò)多、胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)[1]。調(diào)節(jié)PCOS激素內(nèi)分泌紊亂是臨床上主要的治療原則。達(dá)英-35含醋酸環(huán)丙孕酮，可以抑制雄激素分泌與合成，臨床上常用于PCOS治療[2]。IR的調(diào)節(jié)在PCOS 治療過(guò)程中的作用越來(lái)越受到重視[3]，鹽酸二甲雙胍是臨床上常用的抗糖尿病藥物，可以增加組織細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，臨床上鹽酸二甲雙胍聯(lián)合達(dá)英-35治療PCOS的報(bào)道較多[4-5]，本研究觀察了鹽酸二甲雙胍聯(lián)合達(dá)英-35治療PCOS對(duì)患者子宮內(nèi)膜的影響，并探討了PI3K-AKT-MDm2通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集2016年2月至2019年1月我院診治的86例PCOS患者，PCOS診斷參照《中國(guó)PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)(2011年)》[6]。排除對(duì)象:伴發(fā)糖尿病、先天性腎上腺皮質(zhì)增生、肝臟疾病或者惡性腫瘤者，曾服用影響胰島素敏感性或者激素類(lèi)藥物者。使用數(shù)字法將患者隨機(jī)分為達(dá)英-35治療組(對(duì)照組)和二甲雙胍+達(dá)英-35治療組(觀察組)，每組43例。對(duì)照組年齡18～37歲，平均(28.16±5.24)歲，病程 11～46個(gè)月，平均(22.18±5.63)個(gè)月，月經(jīng)初潮年齡12～15歲，平均(13.32±1.02)歲;觀察組年齡20～40歲，平均(28.42±5.35)歲，病程 10～45個(gè)月，平均(22.33±5.71)個(gè)月，月經(jīng)初潮年齡11～15歲，平均(13.18±1.14)歲。兩組患者在年齡構(gòu)成、病程長(zhǎng)度、月經(jīng)初潮年齡方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。另外，選擇我院16例非PCOS患者正常子宮內(nèi)膜組織(輸卵管因素不孕經(jīng)前或卵巢良性腫瘤術(shù)前行診刮術(shù)者)作為非PCOS對(duì)照組，年齡20～39歲，平均(28.25±5.14)歲，月經(jīng)初潮年齡12～16歲，平均(13.58±1.09)歲。PCOS患者與非PCOS對(duì)照組在年齡構(gòu)成和月經(jīng)初潮年齡方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究所有患者均通過(guò)我院倫理委員會(huì)審核，所有受試者均知曉本研究并簽署知情同意書(shū)。

1.2 治療方法 對(duì)照組:于月經(jīng)第5天起服用達(dá)英-35(德國(guó)先靈藥業(yè)，醋酸環(huán)丙孕酮2 mg、炔雌醇0.035 mg)1片/d，連服21 d為1個(gè)療程，共3個(gè)療程。觀察組:達(dá)英-35用藥同對(duì)照組，同時(shí)，餐前0.5 h嚼服二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司，0.5 g)，250 mg/次，2次/d，連用3個(gè)療程。

1.3 臨床觀察指標(biāo) 抽取PCOS患者靜脈血，交由檢驗(yàn)科，使用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定治療前和療程結(jié)束后的卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、睪酮(T)，使用葡萄糖氧化酶法測(cè)定空腹胰島素(FINS)、空腹血糖(FBG)，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR=FINS×FBG/22.5)。檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma-aldrich公司。計(jì)算治療前后PCOS患者體重指數(shù)(BMI，kg/m2)。采用陰道超聲(TVB)測(cè)量治療前后PCOS患者卵巢體積以及子宮內(nèi)膜厚度。

1.4 子宮內(nèi)膜的免疫組化染色檢測(cè) 于閉經(jīng)或陰道淋漓出血時(shí)行診刮取PCOS患者子宮內(nèi)膜組織，福爾馬林固定后送病理科，石蠟包埋制作4 μm 組織樣本切片，PI3K、p-AKT、AKT、MDm2抗體購(gòu)自美國(guó)cell signal公司，嚴(yán)格按照抗體說(shuō)明書(shū)操作加入相關(guān)抗體(1∶100稀釋)，濕盒孵育過(guò)夜，加入生物素辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，顯示劑反應(yīng)顯示后蘇木精復(fù)染。整個(gè)操作使用全自動(dòng)IHC平臺(tái)Leica Bond-Max完成，棕色為陽(yáng)性染色，染色評(píng)分=面積分?jǐn)?shù)(陽(yáng)性染色細(xì)胞比例)×染色強(qiáng)度(1=低強(qiáng)度，2=中強(qiáng)度，3=高強(qiáng)度染色)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料同個(gè)體治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)量資料組間兩兩比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，多組均數(shù)的比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組PCOS患者治療前后臨床指標(biāo)的變化 治療前，兩組PCOS患者FSH、LH、T、HOMA-IR和BMI比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療后，兩組FSH、LH、T、HOMA-IR、BMI水平降低(P<0.05，P<0.01)，且觀察組低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 兩組PCOS患者卵巢和子宮內(nèi)膜的變化 治療前，兩組PCOS患者左右側(cè)卵巢體積和子宮內(nèi)膜厚度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療后，兩組左右側(cè)卵巢體積和子宮內(nèi)膜厚度均顯著減小(P<0.01)，且觀察組小于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 二甲雙胍對(duì)PCOS患者子宮內(nèi)膜PI3K-AKT-MDm2的影響 PCOS患者子宮內(nèi)膜PI3K、p-AKT、AKT、MDm2蛋白染色評(píng)分顯著高于非PCOS對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，對(duì)照組子宮內(nèi)膜PI3K、p-AKT、AKT、MDm2蛋白染色評(píng)分顯著高于觀察組(P<0.01)，見(jiàn)表3、圖1。

表1 兩組患者治療前后臨床指標(biāo)比較

注:與治療前比較，*P<0.05，**P<0.01;與對(duì)照組比較，#P<0.05

3 討論

PCOS在育齡期女性中的患病率為7%～10%，患者以排卵功能障礙、多囊卵巢和高雄激素血癥為特征[7]，患者無(wú)法產(chǎn)生孕激素來(lái)平衡雌激素，在雌激素長(zhǎng)期作用下，患者的子宮內(nèi)膜受到影響，增生過(guò)多，甚至癌變[8]。有報(bào)道，40歲以下子宮內(nèi)膜癌患者中約19%～25%伴發(fā)PCOS[9-10]。達(dá)英-35是炔雌醇和雄激素受體拮抗劑醋酸環(huán)丙孕酮組成的復(fù)方制劑，可以調(diào)節(jié)PCOS患者的激素異常，是臨床上首選治療藥物。然而，有研究顯示，單獨(dú)達(dá)英-35治療效果并不理想[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胰島素抵抗在PCOS患者激素紊亂中的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)[12-14]，因此，胰島素增敏劑開(kāi)始受到臨床工作者的關(guān)注。二甲雙胍是常用的抗糖尿病藥物，可以增加組織細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性[15-16]。本研究顯示，治療后，觀察組患者FSH、LH、T、HOMA-IR、BMI均低于對(duì)照組，說(shuō)明加用二甲雙胍拮抗胰島素抵抗后，患者的激素紊亂得到了有效糾正。進(jìn)一步的卵巢體積和子宮內(nèi)膜厚度檢查發(fā)現(xiàn)，治療后，觀察組卵巢體積和子宮內(nèi)膜厚度均小于對(duì)照組，表明拮抗胰島素抵抗更有利于患者卵巢和子宮內(nèi)膜的恢復(fù)。

表2 兩組患者治療前后卵巢體積和子宮內(nèi)膜厚度比較

注:與治療前比較，**P<0.01;與對(duì)照組比較，#P<0.05

表3 三組患者子宮內(nèi)膜PI3K、p-AKT、AKT、MDm2蛋白染色評(píng)分比較

注:與治療前比較，**P<0.01;與對(duì)照組比較，##P<0.01

圖1 三組患者子宮內(nèi)膜PI3K、p-AKT、AKT、MDm2蛋白的免疫組化染色(200×)

磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號(hào)通路是機(jī)體內(nèi)細(xì)胞增殖的重要通路，PI3K由催化亞基pl10 和抑制性調(diào)節(jié)亞基p85組成，生長(zhǎng)信號(hào)激活時(shí)，2個(gè)亞基分離，激活亞基pl10的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，進(jìn)一步磷酸化下游的Akt[17]。PI3K/Akt通路在孕婦的胰島素抵抗以及子宮內(nèi)膜的增殖中發(fā)揮重要作用[18]。雙微體(Murine double minute2，MDm2)基因是PI3K/Akt下游的靶基因，MDm2的靶基因是P53，PI3K/AKT通路活化，會(huì)導(dǎo)致MDm2表達(dá)升高，引起p53快速降解，引起細(xì)胞的異常增殖[19]，因此，PI3K-AKT-MDm2通路在子宮內(nèi)膜增殖以及子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中都發(fā)揮了積極的作用。本研究以正常子宮內(nèi)膜作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)PCOS患者子宮內(nèi)膜PI3K、p-AKT、AKT、MDm2蛋白表達(dá)顯著升高，表明 PCOS患者子宮內(nèi)膜存在PI3K-AKT-MDm2通路的過(guò)度激活;觀察組PCOS患者子宮內(nèi)膜PI3K、p-AKT、AKT、MDm2蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組，表明二甲雙胍可以抑制PCOS患者PI3K-AKT-MDm2通路的激活，這可能是二甲雙胍抑制PCOS患者子宮內(nèi)膜增殖的機(jī)制[20]。蘇椿淋等[21]研究顯示，達(dá)英-35聯(lián)合二甲雙胍治療PCOS合并子宮內(nèi)膜不典型增生及早期子宮內(nèi)膜樣腺癌，可以使患者子宮內(nèi)膜病變完全轉(zhuǎn)化，二甲雙胍治療是否可以降低PCOS子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生率有待長(zhǎng)期隨訪來(lái)揭示。

綜上所述，本研究顯示，二甲雙胍通過(guò)抑制PCOS患者子宮內(nèi)膜PI3K-AKT-MDm2通路，抑制子宮內(nèi)膜的增殖。