高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定黃瓜中啶蟲脒殘留

楊帆 ，李璇 ，2，司升云

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，430345；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

啶蟲脒（acetamiprid）是繼吡蟲啉和烯啶蟲胺后發(fā)現(xiàn)的第3個(gè)優(yōu)良的氯化新煙堿類殺蟲劑[1]。該藥劑作用于昆蟲綱神經(jīng)系統(tǒng)后突觸的乙酰膽堿受體，有觸殺、胃毒和較強(qiáng)的滲透作用，殺蟲廣譜、持效期長(zhǎng)、內(nèi)吸性強(qiáng)，在土壤中穩(wěn)定性好[2,3]。啶蟲脒的作用機(jī)制與傳統(tǒng)的有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類不同，故對(duì)傳統(tǒng)殺蟲劑有抗性的害蟲有特效，是有機(jī)磷酸酯類農(nóng)藥的有效代替品[4]。近年來(lái)，啶蟲脒在黃瓜等蔬菜作物上廣泛應(yīng)用，歐盟目前規(guī)定的啶蟲脒在果菜類蔬菜中的最大殘留限量值（maximum residue limit，MRL）為0.3 mg/kg，日本規(guī)定其在黃瓜上的MRL值為5 mg/kg，我國(guó)在GB 2763-2019中最新規(guī)定啶蟲脒在黃瓜中的MRL值為1 mg/kg[5]。在國(guó)家對(duì)啶蟲脒生物安全性評(píng)價(jià)及殘留限量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步規(guī)范后，啶蟲脒殘留分析的檢測(cè)方法也需進(jìn)一步完善。

目前啶蟲脒殘留分析的常用檢測(cè)方法有氣相色譜法（gas chromatographic，GC）[6，7]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[8，9]和氣相色譜-質(zhì)譜法 （gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS）[10～12]，但這些方法多需要其他手段輔助，操作過(guò)程較為復(fù)雜。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）使得農(nóng)藥殘留測(cè)定的精確度更高，逐漸成為農(nóng)藥殘留分析發(fā)展的新趨勢(shì)。但是LC-MS技術(shù)成本較高，而且此方法普遍存在基質(zhì)效應(yīng)，如果在樣品前處理、內(nèi)標(biāo)使用、色譜分離和質(zhì)譜分析等過(guò)程中參數(shù)選擇不當(dāng)，會(huì)直接影響該方法的靈敏度和精確度。已有研究使用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)茶葉中啶蟲脒進(jìn)行殘留分析[13～15]，也有該技術(shù)在大田作物[16]及果蔬[17～20]農(nóng)藥殘留測(cè)定中應(yīng)用的報(bào)道。本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 （high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS） 測(cè)定了黃瓜植株、果實(shí)和土壤中的啶蟲脒殘留，對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行了改良，并建立了基于定量離子的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）；20%啶蟲脒可溶性液劑（上海生農(nóng)生化制品股份有限公司）；色譜級(jí)甲醇（Tedia公司）；十八烷基鍵和硅膠吸附劑C18、乙二胺基-N-丙基吸附劑PSA、石墨化炭黑吸附劑GCB、乙腈、乙酸、甲酸（國(guó)產(chǎn)色譜純）、無(wú)水乙酸鈉、無(wú)水硫酸鎂、乙酸銨（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters ACQUITY UPLC高效液相色譜儀（Waters公司）；Xevo TQ 質(zhì)譜儀（Waters公司）；臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)SORVAL公司）；AR5120電子天平（美國(guó)AHOMS公司）；IKAT18勻漿機(jī) （德國(guó)IKA公司）；UYC-200全溫培養(yǎng)搖床 （上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；氮吹儀（杭州米歐儀器有限公司）；超綠16型背負(fù)式手動(dòng)噴霧器（西班牙MATABI公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

①樣品前處理 準(zhǔn)確稱取10.00 g（精確至0.01 g）已均質(zhì)的樣品于50 mL離心管，加入3顆玻璃彈珠及 15 mL 乙腈（含 1%乙酸，乙腈∶乙酸=99∶1），渦旋振蕩2 min，加入1 g無(wú)水乙酸鈉和4 g無(wú)水硫酸鎂的混合萃取填料，迅速手搖震蕩30 s至充分混勻；3 800 r/min離心3 min，取6 mL上清液于15 mL離心管待凈化；向提取液中加入300 mg PSA、300 mg C18、22.5 mg GCB、900 mg 無(wú)水硫酸鎂，渦旋震蕩30 s；3 800 r/min 離心 3 min，取 1.5 mL 上清液于10 mL玻璃試管中；55℃溫浴氮吹至溶液近干，而后以甲醇定容至1 mL，過(guò)0.22 μm濾膜，待UPLC-MS/MS檢測(cè)。

②標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 以甲醇為溶劑配制梯度為2、5、20、50、200、500、1 000 μg/L 的啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)溶液。

③色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC R BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫 40℃。流動(dòng)相 A：98/2=水/[甲醇（V/V）+0.05%甲酸+5 mmol/L乙酸銨]；流動(dòng)相 B：乙腈；流速 0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；樣品室溫度10℃。液相梯度參數(shù)見(jiàn)表1。

④質(zhì)譜條件 電離方式為電噴霧電離 （ESI）正負(fù)離子切換；毛細(xì)管電壓3.0 kV；離子源溫度150℃；錐孔反吹氣流量50 L/hr；脫溶劑氣溫度400℃；脫溶劑氣流量800 L/hr；監(jiān)測(cè)模式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。質(zhì)子化的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件（[M+H]+）見(jiàn)表2。

表1 液相梯度參數(shù)

表2 質(zhì)子化的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件（[M+H]+）

1.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

按照本方法檢測(cè)啶蟲脒在大棚黃瓜果實(shí)和土壤中的殘留量。

①小區(qū)設(shè)計(jì) 設(shè)殘留低劑量處理區(qū)和殘留高劑量處理區(qū)，以生產(chǎn)中20%啶蟲脒可溶性液劑葉面噴霧法防治黃瓜瓜蚜的推薦劑量 （有效成分72 g/hm2）和2倍推薦劑量（有效成分144 g/hm2）分別作為最終殘留試驗(yàn)的低劑量和高劑量。每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)為1個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積15 m2，各小區(qū)之間設(shè)保護(hù)行。設(shè)空白對(duì)照小區(qū)，并與處理區(qū)設(shè)有效隔離帶，以避免藥劑的揮發(fā)、漂移和淋溶污染。

表3 啶蟲脒在黃瓜樣品中的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

②施藥方法及樣品采集 于瓜蚜發(fā)生盛期開始施藥，間隔期10 d，共施藥3次。最后1次施藥后1、2、3、5、7 d分別采集黃瓜果實(shí)和土壤樣品，用于啶蟲脒含量測(cè)定。每個(gè)小區(qū)隨機(jī)采集成熟、健康、無(wú)病害果實(shí)不少于2 kg，去除果梗后裝入自封袋；用土壤取樣器隨機(jī)采集0～10 cm深的地表土，每小區(qū)設(shè)3個(gè)取樣點(diǎn)，總?cè)恿坎簧儆? kg，去除雜質(zhì)后裝入自封袋。所有樣品攜至室內(nèi)采用四分法縮分后各留樣200～500 g，用錫箔紙包好裝入自封袋，保存于-20°C低溫冰箱中，待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取凈化方法改良

乙腈是農(nóng)藥提取最常用的溶劑，對(duì)多種有機(jī)農(nóng)藥的提取效果都十分明顯，本試驗(yàn)采用乙腈（含1%乙酸）溶液提取黃瓜中啶蟲脒，改用無(wú)水乙酸鈉和無(wú)水硫酸鎂去除水分，除加入C18、PSA填料凈化外，改良加入GCB對(duì)提取液吸附凈化，最后以氮?dú)獯祾叻绞綕饪s樣品。這種方法流程簡(jiǎn)便，提取過(guò)程中對(duì)待測(cè)物損失較小。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

啶蟲脒為弱酸性煙堿類化合物，適宜選擇正離子模式進(jìn)行檢測(cè)。啶蟲脒共檢測(cè)223/126.0和223/56.1共2個(gè)碎片離子，其中223/126.0選為定量離子，以該離子檢測(cè)響應(yīng)值對(duì)樣品中啶蟲脒定量；223/56.1碎片離子為定性離子。

2.3 線性關(guān)系的確定線性范圍與靈敏度

將配制的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果以峰面積Y對(duì)質(zhì)量濃度X（μg/L）作校準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。啶蟲脒在2～1 000 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，校正曲線為Y=939.092 X+62.353 1，相關(guān)系數(shù)（R2）大于 0.999。 定量限為 0.25 μg/kg，檢出限為 0.05 μg/kg。

圖1 啶蟲脒在濃度范圍內(nèi)的校準(zhǔn)曲線

2.4 回收率與準(zhǔn)確度

本方法中啶蟲脒檢出限低于MRL值（1 mg/kg），因此設(shè)置添加水平為0.5倍、1倍和2倍MRL值，即以黃瓜空白樣品中添加500、1 000、2 000 μg/kg 3 個(gè)水平的啶蟲脒進(jìn)行回收率試驗(yàn)。每個(gè)添加水平進(jìn)行6次重復(fù)。表3結(jié)果表明，平均回收率為88.8%～106.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）為2.3%～7.0%，符合GB/T 27404-2008中回收率范圍在80%～110%的規(guī)定。說(shuō)明此方法的回收率較高，符合殘留分析要求。黃瓜樣品空白及最低添加水平的樣品添加的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見(jiàn)圖2。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

在建立了啶蟲脒的HPLC-MS/MS定量分析方法及相應(yīng)的樣品前處理技術(shù)后，按本方法檢測(cè)了啶蟲脒在大棚黃瓜果實(shí)和土壤中的殘留量。結(jié)果表明，黃瓜果實(shí)中啶蟲脒的最終殘留量范圍為0.012 1～0.048 5 mg/kg，土壤中啶蟲脒的最終殘留量范圍為0.000 5～0.050 9 mg/kg。說(shuō)明該方法精度較高，完全能滿足實(shí)際檢測(cè)需要（圖3）。

圖3 啶蟲脒低劑量和高劑量處理下在黃瓜果實(shí)（a）和土壤（b）中的最終殘留量

3 結(jié)論

本研究采用乙腈（含1%乙酸）溶液提取黃瓜中啶蟲脒，提取效果十分優(yōu)良。提取液改用無(wú)水乙酸鈉和無(wú)水硫酸鎂去除水分，除加入C18、PSA填料凈化之外，改良加入GCB對(duì)提取液吸附凈化，最后以氮?dú)獯祾叻绞綕饪s樣品。這種方法流程簡(jiǎn)便，提取過(guò)程中對(duì)待測(cè)物損失較小，提取物更加純凈，不用過(guò)多的凈化步驟就可準(zhǔn)確測(cè)出大部分痕量待測(cè)物，大大縮短了單個(gè)樣品的檢測(cè)時(shí)間。質(zhì)譜采用ESI為離子源，經(jīng)MRM監(jiān)測(cè)模式掃描，選定223/126.0為定量離子，以該離子檢測(cè)響應(yīng)值對(duì)樣品中啶蟲脒定量，最大程度的降低了基質(zhì)干擾對(duì)定量分析的影響。檢出限為0.05 μg/kg，具有很高的準(zhǔn)確度和精密度，且在2～1 000 μg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999，平均添加回收率為88.8%～106.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%～7.0%，實(shí)際樣品檢測(cè)精度可達(dá)0.001 mg/kg，符合國(guó)家殘留分析方法測(cè)試要求。