氨氮對(duì)河川沙塘鱧胚胎和仔魚(yú)的急性毒性研究

劉國(guó)興,鄭 友,霍春林,史楊白,丁淑燕,郝 忱,魏萬(wàn)紅

(1.揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009;2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所,江蘇 南京 210017)

氨氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中最常見(jiàn)的污染物之一,其在水中主要以離子氨(NH4+)和非離子氨(NH3)兩種形式存在,兩者之間可以相互轉(zhuǎn)化,處于動(dòng)態(tài)平衡[1-2]。NH4+對(duì)魚(yú)類的毒性較小,而NH3具有脂溶性,能穿透細(xì)胞膜,進(jìn)而對(duì)魚(yú)類產(chǎn)生較強(qiáng)的毒害作用[3]。在高密度集約化的魚(yú)類育苗或養(yǎng)殖系統(tǒng)中,魚(yú)類的卵膜、排泄物及殘余餌料等有機(jī)物經(jīng)氨化作用產(chǎn)生大量氨氮,影響魚(yú)類的生長(zhǎng)發(fā)育、呼吸代謝和免疫功能,甚至引起魚(yú)類暴發(fā)性疾病,造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。

河川沙塘鱧(Odontobutispotamophila)隸屬鱸形目、塘鱧科,俗稱虎頭鯊、慈姑呆子和塘鱧魚(yú)等,是我國(guó)特有的一種小型經(jīng)濟(jì)魚(yú)類,主要分布于長(zhǎng)江中下游及沿江各支流、錢塘江水系和閩江水系,偶見(jiàn)于黃河水系[6]。該魚(yú)味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富,深受廣大消費(fèi)者的歡迎,已成為我國(guó)水產(chǎn)業(yè)極具發(fā)展?jié)摿Φ奶厣B(yǎng)殖品種[7]。隨著2014年江蘇省淡水水產(chǎn)研究所率先攻克河川沙塘鱧苗種規(guī)?；庇夹g(shù)難關(guān)并創(chuàng)建了具有區(qū)域特色的蝦蟹塘套養(yǎng)河川沙塘鱧高效養(yǎng)殖模式,江蘇各地河川沙塘鱧的養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大。

近年來(lái),本項(xiàng)目組發(fā)現(xiàn),由于在河川沙塘鱧苗種孵化和幼體培育的整個(gè)過(guò)程中,通常不換水或僅少量換水,因而水體中氨氮不斷積累,其可能是影響河川沙塘鱧苗種孵化率與存活率，甚至是導(dǎo)致疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素。目前,有關(guān)氨氮對(duì)河川沙塘鱧毒性作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,我們以河川沙塘鱧為試驗(yàn)材料,采用96 h半靜水急性毒性測(cè)定方法,研究了不同濃度氨氮對(duì)河川沙塘鱧胚胎和仔魚(yú)的毒性作用,旨在為河川沙塘鱧繁育實(shí)踐中的水質(zhì)管理提供科學(xué)依據(jù),同時(shí)也為河川沙塘鱧毒理學(xué)研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用河川沙塘鱧親魚(yú)由江蘇省淡水水產(chǎn)研究所揚(yáng)中基地提供,挑選體表無(wú)損傷、體質(zhì)健壯、性腺發(fā)育良好的個(gè)體作為試驗(yàn)親魚(yú)(雌、雄親魚(yú)各25尾),體長(zhǎng)(107.03±4.45)mm,體質(zhì)量(40.91±1.78)g,將它們飼養(yǎng)于育種車間的產(chǎn)卵缸中(3 m×1 m×0.6 m)。每日17:00～18:00按體質(zhì)量的5%～8%足量投喂鮮活淡水糠蝦,次日6:00吸污換水1/3。采用紅外攝像自動(dòng)記錄系統(tǒng),全程記錄試驗(yàn)親魚(yú)的各種行為。當(dāng)觀察到試驗(yàn)親魚(yú)具明顯的發(fā)情行為時(shí),采取半干法人工授精,用黃泥漿脫黏。將受精卵置于充氧水中孵化,水溫從自然溫度逐漸升至25 ℃,并保持恒定。隨機(jī)挑選形態(tài)完好、處于同一發(fā)育時(shí)期(體節(jié)期)的河川沙塘鱧胚胎用作試驗(yàn)胚胎，胚胎發(fā)育分期參照張君等的方法[8]。試驗(yàn)仔魚(yú)為孵化出膜7日齡的河川沙塘鱧。

試驗(yàn)用水為經(jīng)過(guò)曝氣48 h的自來(lái)水,水溫(25±1)℃, pH 8.0±0.1,溶解氧超過(guò)6 mg/L,氨氮濃度低于0.01 mg/L,自然光照。

試驗(yàn)藥物NH4Cl(分析純)經(jīng)105 ℃烘干至恒重,準(zhǔn)確稱樣后以試驗(yàn)用水配制成10 g/L的母液,在試驗(yàn)時(shí)按比例稀釋至所需濃度。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 氨氮對(duì)河川沙塘鱧胚胎的急性毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組：對(duì)照組僅用試驗(yàn)用水；根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果,按照等對(duì)數(shù)間距設(shè)置試驗(yàn)組的氨氮濃度梯度,分別為40.00、63.40、100.48、159.24、252.38和400.00 mg/L。對(duì)照組和試驗(yàn)組各濃度梯度均設(shè)3個(gè)平行,共用21個(gè)培養(yǎng)皿(直徑18 cm，高2 cm)。在每個(gè)培養(yǎng)皿中放入20枚試驗(yàn)胚胎,試驗(yàn)液為350 mL,水溫控制在(25±1)℃, pH 8.0±0.1,溶解氧超過(guò)5 mg/L。每24 h更換1次試驗(yàn)液,更換量為100%。試驗(yàn)期間不充氣,定時(shí)檢查試驗(yàn)胚胎的發(fā)育和死亡情況,及時(shí)剔除死亡胚胎,準(zhǔn)確記錄24 h、48 h、72 h和96 h的死亡枚數(shù)。死亡胚胎的判斷標(biāo)準(zhǔn)：胚胎被觸動(dòng)5 s,胚體無(wú)任何反應(yīng)即定義為死亡[9]。

1.2.2 氨氮對(duì)河川沙塘鱧仔魚(yú)的急性毒性試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)確定的濃度區(qū)間,按照等對(duì)數(shù)間距設(shè)置6個(gè)試驗(yàn)濃度組,分別為10.00、15.16、22.97、34.82、52.78和80.00 mg/L,同時(shí)設(shè)1個(gè)對(duì)照組,對(duì)照組僅用試驗(yàn)用水。每組3個(gè)平行,共用21個(gè)玻璃燒杯(容積2000 mL)。在每個(gè)玻璃燒杯中放入10尾試驗(yàn)仔魚(yú),試驗(yàn)液為1000 mL,水溫控制在(25±1)℃, pH 8.0±0.1,溶解氧超過(guò)5 mg/L。在試驗(yàn)前一天停食,在整個(gè)試驗(yàn)期間不投喂、不充氣,每24 h更換1次試驗(yàn)液,更換量為100%。定時(shí)觀察試驗(yàn)仔魚(yú)的活動(dòng)狀況和死亡情況,及時(shí)撈出死亡仔魚(yú),準(zhǔn)確記錄24 h、48 h、72 h和96 h的死亡尾數(shù)。死亡仔魚(yú)的判斷標(biāo)準(zhǔn)：仔魚(yú)被觸動(dòng)5 s,魚(yú)體無(wú)任何反應(yīng)即定義為死亡[9]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù),采用直線內(nèi)插法求出24 h、48 h、72 h和96 h氨氮的半致死濃度(LC50)。安全濃度(SC)的計(jì)算公式[10]:SC=0.1×96 h時(shí)的LC50。非離子氨的計(jì)算公式[11]:非離子氨濃度=氨氮濃度/[10(pKa-pH)+1],其中pKa=0.09018+2729.92/T(T為絕對(duì)溫度,T=273+t℃)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮對(duì)河川沙塘鱧胚胎的急性毒性

氨氮對(duì)河川沙塘鱧胚胎的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。在同一處理時(shí)間下,隨著氨氮濃度的增加,河川沙塘鱧胚胎的死亡率逐漸上升。在同一氨氮濃度條件下,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),河川沙塘鱧胚胎的死亡率逐漸增加。對(duì)照組和氨氮濃度為40.00 mg/L時(shí),河川沙塘鱧胚胎在96 h內(nèi)未見(jiàn)死亡。當(dāng)氨氮濃度為400.00 mg/L時(shí),河川沙塘鱧胚胎在24 h、48 h、72 h和96 h的死亡率均為100%。

表1 氨氮對(duì)河川沙塘鱧胚胎急性毒性的試驗(yàn)結(jié)果

氨氮對(duì)河川沙塘鱧胚胎的半致死濃度及安全濃度結(jié)果如表2所示。采用直線內(nèi)插法對(duì)表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,求出氨氮對(duì)河川沙塘鱧胚胎24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為153.02、139.20、123.59和98.13 mg/L,SC為9.81 mg/L;轉(zhuǎn)化為非離子氨的LC50分別為8.13、7.40、6.57和5.21 mg/L,SC為0.52 mg/L。

表2 氨氮對(duì)河川沙塘鱧胚胎的半致死濃度及安全濃度

2.2 氨氮對(duì)河川沙塘鱧仔魚(yú)的急性毒性

氨氮對(duì)河川沙塘鱧仔魚(yú)的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。對(duì)照組和氨氮濃度為10.00 mg/L時(shí),河川沙塘鱧仔魚(yú)在96 h內(nèi)無(wú)死亡。隨著氨氮濃度的增加,其對(duì)河川沙塘鱧仔魚(yú)的毒害作用增強(qiáng),其死亡率逐漸上升。在同一氨氮濃度條件下,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),河川沙塘鱧仔魚(yú)的死亡率逐漸增加。當(dāng)氨氮濃度為80.00 mg/L時(shí),河川沙塘鱧仔魚(yú)在72 h和96 h的死亡率均為100%。

氨氮對(duì)河川沙塘鱧仔魚(yú)的半致死濃度及安全濃度結(jié)果如表4所示。根據(jù)表3中的數(shù)據(jù),建立24 h、48 h、72 h和96 h的氨氮濃度對(duì)數(shù)(x)與河川沙塘鱧仔魚(yú)死亡率(y)間的直線回歸方程,依據(jù)方程求出氨氮對(duì)河川沙塘鱧仔魚(yú)24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為54.52、40.63、30.32和26.16 mg/L,SC為2.62 mg/L;轉(zhuǎn)化為非離子氨的LC50分別為2.90、2.16、1.61和1.39 mg/L,SC為0.14 mg/L。

表3 氨氮對(duì)河川沙塘鱧仔魚(yú)急性毒性的試驗(yàn)結(jié)果

表4 氨氮對(duì)河川沙塘鱧仔魚(yú)的半致死濃度及安全濃度

3 討論

3.1 氨氮對(duì)河川沙塘鱧胚胎的急性毒性

在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中,氨氮特別容易達(dá)到毒性水平,并且作為一種限制因子影響魚(yú)類的生長(zhǎng)發(fā)育和健康水平[12]。有關(guān)氨氮對(duì)魚(yú)類的毒性效應(yīng)研究較多,但是對(duì)魚(yú)類早期生活史階段(尤其是魚(yú)類胚胎期)的毒性效應(yīng)研究較少[13]。Broderius等[14]研究發(fā)現(xiàn),在pH值為6.60～8.68、氨濃度為0.236～0.865 mg/L條件下,小口黑鱸(MicropterusdolomieuiLacepede)胚胎至孵化出膜7 d期間仔魚(yú)的存活率無(wú)明顯變化。據(jù)Solbé和Shurben報(bào)道[15],在受精24 h內(nèi)開(kāi)始暴露試驗(yàn),當(dāng)非離子氨濃度為0.027 mg/L時(shí),虹鱒(Salmogairdneri)受精卵的死亡率超過(guò)70%。Barimo和Walsh[16]的研究結(jié)果表明,總氨對(duì)海灣豹蟾魚(yú)(Opsanusbeta)胚胎96 h的LC50為63.6 mmol/L。本試驗(yàn)結(jié)果表明,隨著氨氮濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng),河川沙塘鱧胚胎的死亡率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。氨氮對(duì)河川沙塘鱧胚胎96 h的LC50為98.13 mg/L,SC為9.81 mg/L;轉(zhuǎn)化為非離子氨的LC50為5.21 mg/L,SC為0.52 mg/L。因此,在河川沙塘鱧苗種孵化過(guò)程中,由于死卵和卵膜等有機(jī)物分解導(dǎo)致孵化水體氨氮濃度升高,因而需要加強(qiáng)水質(zhì)監(jiān)測(cè), 適時(shí)采取水質(zhì)調(diào)控措施,確保孵化水體中氨氮濃度和非離子氨濃度不超過(guò)安全濃度,從而提高河川沙塘鱧苗種的孵化率和繁育成效。

3.2 氨氮對(duì)河川沙塘鱧仔魚(yú)的急性毒性

在本試驗(yàn)期間,對(duì)照組和氨氮濃度為10.00 mg/L時(shí),河川沙塘鱧仔魚(yú)在96 h內(nèi)無(wú)死亡。隨著氨氮濃度升高,仔魚(yú)的中毒癥狀越發(fā)明顯。在中毒初期,仔魚(yú)表現(xiàn)為游動(dòng)急促或上下竄跳,呼吸急促,時(shí)而出現(xiàn)痙攣癥狀。隨著中毒時(shí)間的延長(zhǎng),魚(yú)體向一側(cè)傾斜或腹部向上,不能翻轉(zhuǎn)至正常游泳姿態(tài),游動(dòng)乏力,呼吸頻率降低。瀕死時(shí),體色變淺,呼吸微弱,游動(dòng)無(wú)力,身體側(cè)翻,失去逃避能力。死亡仔魚(yú)鰓蓋及口裂張開(kāi),魚(yú)體僵直,沉入水底。

本試驗(yàn)結(jié)果表明,隨著氨氮濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng),氨氮對(duì)河川沙塘鱧仔魚(yú)的毒害作用增強(qiáng),其死亡率逐漸上升。氨氮對(duì)河川沙塘鱧仔魚(yú)24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為54.52、40.63、30.32和26.16 mg/L,SC為2.62 mg/L;轉(zhuǎn)化為非離子氨的LC50分別為2.90、2.16、1.61和1.39 mg/L,SC為0.14 mg/L。截至目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者在氨氮/非離子氨對(duì)仔、稚、幼魚(yú)的毒性效應(yīng)方面開(kāi)展了大量的研究工作,但由于非離子氨、LC50和SC計(jì)算方法以及試驗(yàn)條件(pH值、溫度、溶解氧、試驗(yàn)用水和試驗(yàn)魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育階段等)各不相同,因此難以對(duì)不同學(xué)者的研究結(jié)果進(jìn)行確切的比較[17]。因此,筆者選取了計(jì)算方法相同、試驗(yàn)條件相近的相關(guān)研究結(jié)果與本文研究結(jié)果進(jìn)行比較。據(jù)魯增輝等[17]報(bào)道,非離子氨對(duì)稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)幼魚(yú)24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為3.00、2.79、2.31和2.06 mg/L,SC為0.21 mg/L。郝小鳳等[18]研究發(fā)現(xiàn),非離子氨對(duì)泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為3.40、2.92、2.51和2.22 mg/L,SC為0.22 mg/L。從上述試驗(yàn)結(jié)果可以看出,雖然同為底層魚(yú)類,但河川沙塘鱧仔魚(yú)對(duì)非離子氨的耐受能力弱于稀有鮈鯽和泥鰍,這可能是由于魚(yú)類生活習(xí)性差異導(dǎo)致其對(duì)非離子氨的耐受性不同。

此外,本研究結(jié)果表明,河川沙塘鱧胚胎對(duì)氨氮和非離子氨的耐受能力明顯強(qiáng)于仔魚(yú)。已有研究表明,海灣豹蟾魚(yú)(O.beta)[16]、稀有鮈鯽(G.rarus)[17]胚胎對(duì)氨的耐受性亦強(qiáng)于幼魚(yú)或成魚(yú),這與本研究結(jié)果一致。據(jù)Barimo和Walsh[16]報(bào)道,氨氮能夠滲透通過(guò)卵膜,卵膜可選擇性地滲透氨/銨鹽或通過(guò)新陳代謝將氨清除,從而減輕氨對(duì)胚胎的毒害作用。

綜上所述,隨著氨氮濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng),河川沙塘鱧胚胎和仔魚(yú)的死亡率逐漸升高。本研究獲得了氨氮對(duì)河川沙塘鱧胚胎和仔魚(yú)的急性毒性結(jié)果,發(fā)現(xiàn)河川沙塘鱧胚胎對(duì)氨氮的耐受能力強(qiáng)于仔魚(yú),本研究結(jié)果可為河川沙塘鱧繁育實(shí)踐中的水質(zhì)管理和毒理學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。