藥對(duì)枳實(shí)-白芍配伍比例對(duì)肝郁脾虛型腸易激綜合征大鼠的藥效學(xué)研究

葉曉梅，王東明，袁康瑞，劉小柳，吳都督，陳 稚*（.廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東東莞53808；. 廣東省深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣東深圳 5800）

腸易激綜合征 (irritable bowel syndrome，IBS)是一類臨床上常見(jiàn)的慢性胃腸道功能紊亂性疾病，以反復(fù)腹痛、腹部不適及排便習(xí)慣改變?yōu)樘卣?，常伴有抑郁、焦慮等癥狀[1-2]。該病在全世界的患病率為1%～20%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，造成了沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[3]。IBS發(fā)病機(jī)制尚未明了，其發(fā)病原因可能與內(nèi)臟高敏感性、精神心理障礙、腦腸軸互動(dòng)異常、腸道屏障受損、菌群失調(diào)、免疫異常等因素有關(guān)[4-7]。

目前對(duì)于該病臨床上并無(wú)特效藥，通常采用匹維溴銨片、比沙可啶、洛哌丁胺、低劑量阿米替林等進(jìn)行對(duì)癥治療，但結(jié)果差強(qiáng)人意[8-9]。因此，需要進(jìn)一步研究有效治療IBS的潛在新療法。

中醫(yī)上認(rèn)為腸易激綜合征與肝脾腎功能失調(diào)有關(guān)，屬于“郁證”“腹痛”“便秘”和“泄瀉”等范疇，應(yīng)以調(diào)和肝脾、疏肝解郁為主要治療原則[10]。枳芍散出自《金匱要略》，枳實(shí)歸脾、胃經(jīng)，行氣滯，瀉滿除煩；白芍歸肝經(jīng)，疏肝止痛；兩者配伍，可調(diào)和肝脾，兼顧氣血，既去腹痛，又除煩滿。研究表明，枳實(shí)白芍配伍，對(duì)產(chǎn)后腹痛、急性脘腹痛等腸道疾病具有治療作用，且兩者配伍比例不同，表現(xiàn)不同的藥效[11-13]。而對(duì)于枳實(shí)芍藥對(duì)治療腸易激綜合征尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究采用乙酸灌腸、夾尾激怒加束縛應(yīng)激的方法復(fù)制了肝郁脾虛型IBS大鼠模型，觀察了不同配比的枳實(shí)-白芍對(duì)IBS大鼠內(nèi)臟敏感性、抗抑郁作用以及對(duì)鎮(zhèn)痛作用的影響，并篩選了枳實(shí)-白芍藥對(duì)治療肝郁脾虛型IBS的最佳配伍比例。為枳實(shí)-白芍藥對(duì)治療肝郁脾虛型腸易激綜合征的合理性和科學(xué)性提供實(shí)驗(yàn)支持，并對(duì)其臨床應(yīng)用提供參考與指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 藥材與試劑

枳實(shí)(產(chǎn)地江西新干，批號(hào)110220)，白芍(產(chǎn)地安徽，批號(hào)YPA2B0001)，均從廣州致信中藥飲片有限公司購(gòu)買。

匹維溴銨片(法國(guó)Abbott Products SAS公司，批號(hào)624757)、阿司匹林片(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20120206)、氯化鈉注射液(國(guó)藥集團(tuán)榮生制藥有限公司，批號(hào)12120342)、乙酸(天津市四友精細(xì)化工品有限公司，批號(hào)130742)

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD種大鼠，雌雄各半，身體質(zhì)量200～220 g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0002；SPF級(jí)KM種小鼠，雌雄各半，身體質(zhì)量18～22 g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(粵)1032018。以上動(dòng)物均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Sartorius LIBROR AEG-220電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)、導(dǎo)尿管(廣州文瑞醫(yī)療器材有限公司)、壓力表(北京醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 建立肝郁脾虛型IBS動(dòng)物模型 將48只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分成8組，每組6只，分別為正常組、IBS模型組、陽(yáng)性組(匹維溴銨組)、白芍組、枳實(shí)組、枳實(shí)-白芍1:1組，枳實(shí)-白芍1:2組，枳實(shí)-白芍2:1組。分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，正常組以普通飼料喂養(yǎng)，其他大鼠采用乙酸灌腸、夾尾激怒和束縛應(yīng)激的方法造模3周，以制備肝郁脾虛型IBS模型。依據(jù)文獻(xiàn)[14-16]對(duì)模型講行評(píng)價(jià)。

1.4.2 制備藥物 設(shè)計(jì)枳實(shí)-白芍1:1、1:2、2:1(質(zhì)量比，下同)3個(gè)不同配比組[13]，稱量藥物溶于6倍體積的蒸餾水；武火加熱至沸騰并持續(xù)沸騰30 min，趁熱過(guò)濾；濾液烘干至質(zhì)量恒定，即得干浸膏，計(jì)算煎出率。使用蒸餾水配制2.5 g/L的匹維溴銨溶液和30 g/L的阿司匹林溶液作為陽(yáng)性組用藥。

1.4.3 分組給藥 正常組模型組均以生理鹽水灌胃；陽(yáng)性組：匹維溴銨溶液(0.025 g/kg)或阿司匹林溶液(0.3 g/kg)灌胃；藥物組：灌胃劑量為6 g/kg(生藥量，其中鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)劑量為9 g/kg)，每天給藥1次，連續(xù)7 d(鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)每天給藥1次，連續(xù)3 d)。

1.4.4 腹部回縮反射實(shí)驗(yàn) 末次給藥后60 min，待大鼠麻醉后，將擴(kuò)張球囊插入結(jié)直腸內(nèi)(深度約為5 cm)，固定大鼠尾巴的根部，待其穩(wěn)定后，將其置于能限制其肢體運(yùn)動(dòng)而不影響呼吸的透明束縛器內(nèi)。30 min后，分別施加20、40、60、80 mmHg的分級(jí)壓力，每級(jí)壓力維持20 s，施壓間隔為5 min，重復(fù)3次。響應(yīng)AWR 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Al-Chaer[17]方法。

1.4.5 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱規(guī)格為80 cm×80 cm×50 cm，內(nèi)分為等面積的25個(gè)方格，正中格上方安置攝像頭。實(shí)驗(yàn)環(huán)境安靜，室內(nèi)亮度與動(dòng)物房夜間亮度一致，實(shí)驗(yàn)均在早上9:00開始以減少生物節(jié)律的影響。將大鼠先置于測(cè)試室10 min以適應(yīng)環(huán)境，將大鼠輕放入實(shí)驗(yàn)箱正中，并記錄大鼠3 min內(nèi)的活動(dòng)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總得分為水平得分和垂直得分之和。水平得分為大鼠越過(guò)的方格數(shù)(四爪均進(jìn)入)，垂直得分為直立次數(shù)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)總得分反應(yīng)了大鼠的興奮程度。另外，還需記錄中央格停留時(shí)間和修飾次數(shù)如前肢理毛、抓癢、洗臉以及舔足等。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束徹底清掃曠場(chǎng)箱。得分基于2人的觀察結(jié)果的平均值。

1.4.6 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) 分組如上，KM種小鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，末次給藥 30 min 后，腹腔注射 0.6%乙酸溶液0.1 mL/10 g，記錄各小鼠20 min內(nèi)扭體反應(yīng)次數(shù)，并計(jì)算其抑制率。扭體反應(yīng)抑制率的計(jì)算公式為：

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析，如方差齊性選用LSD分析方法，如方差不齊選用Dunnett’s T3分析方法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 枳實(shí)、白芍及其不同比例對(duì)模型大鼠腸道敏感性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以動(dòng)物腹部回縮反射(AWR)來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物的內(nèi)臟敏感性[18]。由表1可見(jiàn)，模型組在不同的擴(kuò)張壓力下AWR評(píng)分均明顯比正常組高，內(nèi)臟敏感性均明顯升高(P<0.01或0.05)；與模型組比較，白芍組、枳實(shí)組和枳實(shí)-白芍1:2組內(nèi)臟敏感性降低，但高于陽(yáng)性組；枳實(shí)-白芍1:1、枳實(shí)-白芍2:1組能明顯降低內(nèi)臟敏感性(P<0.01或0.05)，且作用與陽(yáng)性組相當(dāng)。

2.2 枳實(shí)、白芍及其不同配伍比例對(duì)模型大鼠曠場(chǎng)行為學(xué)的影響結(jié)果

由表2可見(jiàn)，與正常組比較，模型組大鼠的總行為次數(shù)明顯減少(P<0.01)，中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間明顯增加(P<0.05)，與中醫(yī)所說(shuō)的“肝郁”相符。給藥后，各給藥組均能不同程度地改善抑郁狀態(tài)。其中白芍組總行為次數(shù)得分最高，中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間最短，抗抑郁作用最好，可能是由于白芍柔肝止痛作用的原因。而在枳實(shí)-白芍藥對(duì)的不同配比中，枳實(shí)-白芍1:1組和枳實(shí)-白芍1:2組中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間較短，表明其抗抑郁作用較好，尤其以枳實(shí)-白芍1:1組最好。另一方面，各組大鼠的修飾次數(shù)差異不大。

2.3 枳實(shí)、白芍及其不同配伍比例對(duì)模型小鼠鎮(zhèn)痛的影響研究

由表3可見(jiàn)，與正常組比較，除枳實(shí)組對(duì)醋酸誘發(fā)的小鼠扭體次數(shù)無(wú)明顯作用外，其余各組均能明顯減少小鼠的扭體次數(shù)(P<0.01或0.05)。而白芍組和枳實(shí)-白芍1:1組對(duì)醋酸誘發(fā)的小鼠疼痛有顯著的抑制作用，特別是枳實(shí)-白芍1:1組與阿司匹林組的抑制率接近，與枳實(shí)-白芍2:1組、枳實(shí)-白芍1:2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明在枳實(shí)-白芍不同配比組中，枳實(shí)-白芍1:1組抑制小鼠的痙攣疼痛作用最強(qiáng)。

表1 對(duì)IBS模型大鼠在不同壓力下的AWR評(píng)分比較 (±s，n=6)

表1 對(duì)IBS模型大鼠在不同壓力下的AWR評(píng)分比較 (±s，n=6)

與正常組相比：aP<0.01，bP<0.05；與模型組相比：cP<0.01，dP<0.05

組別正常組模型組匹維溴銨組白芍組枳實(shí)組枳實(shí)-白芍1:1組枳實(shí)-白芍2:1組枳實(shí)-白芍1:2組劑量/(g/kg)20 mmHg 40 mmHg 60 mmHg 80 mmHg－ －0.41±0.49d1.59±1.05b0.25d6 6 6 6 6 0.51±0.21 1.23±0.74 0.72±0.62d0.44±0.33d0.34±0.35d0.67±0.39d0.68±0.61c1.97±0.96d2.78±0.98c2.65±1.02a3.45±1.12d4.01±0.17a0.79±0.31cdd2.06±0.63b1.85±0.78b2.06±0.72 2.85±0.51 2.71±0.46 3.01±0.32 3.53±0.52 3.61±0.49 1.45±0.31d1.81±0.55c2.65±0.71c1.53±0.65d2.01±0.52dc1.81±0.53b2.11±0.50d2.73±0.42 3.27±0.59

表2 對(duì)IBS模型大鼠曠場(chǎng)行為的影響 (±s，n=6)

表2 對(duì)IBS模型大鼠曠場(chǎng)行為的影響 (±s，n=6)

與正常組相比：aP<0.01，bP<0.05；與模型組相比：cP<0.01，dP<0.05；枳實(shí)-白芍不同配比組中，與枳實(shí)-白芍1:1組相比：eP<0.05；與枳實(shí)-白芍2:1組相比：fP <0.05

組別正常組模型組匹維溴銨組白芍組枳實(shí)組枳實(shí)-白芍1:1組枳實(shí)-白芍2:1組枳實(shí)-白芍1:2組劑量/(g/kg)總行為次數(shù) 中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間/s－ －67.78±19.15c1.01±0.83d25.98±10.01 0.25 6 6 6 6 6 a 20.56±15.01bd37.05±26.07a57.71±36.14 45.52±10.031.41±1.01d36.93±8.56 37.35±11.83 b 29.05±13.38a3.09±2.45df31.00±10.59 43.10±3.95 a修飾次數(shù)4.15±1.82 3.34±1.31 4.23±2.84 3.54±1.91 2.05±1.87 3.15±2.01 3.40±1.96 4.03±3.21 21.59±4.08be4.51±2.56df

表3 對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響 (±s，n=6)

表3 對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響 (±s，n=6)

與正常組相比：aP<0.01，bP<0.05；與阿司匹林組相比：cP<0.01；枳實(shí)-白芍不同配比組中，與枳實(shí)-白芍1:1組相比：dP<0.01，與枳實(shí)-白芍2:1組相比：eP<0.01

扭體反應(yīng)次數(shù)組別正常組阿司匹林組白芍組枳實(shí)組枳實(shí)-白芍1:1組枳實(shí)-白芍2:1組枳實(shí)-白芍1:2組劑量/(g/kg)－0.3 61.10±8.31c25.30±4.65a9 9 9 9 9 32.20±6.99a59.90±9.07c27.70±7.90ae48.80±7.91bcd42.70±6.74acd抑制率/%-58.59 47.29 1.96 54.66 20.13 30.11

3 討論

肝郁脾虛型IBS大鼠模型是一種以腹痛、腹瀉為主要特征，具有“肝郁脾虛證”的非器質(zhì)性疾病模型。肝郁脾虛型IBS大鼠模型有多種造模方法，如母嬰分離、乙酸刺激加束縛應(yīng)激法；乙酸灌腸加夾尾刺激法；饑飽失常、番瀉葉灌胃加強(qiáng)迫游泳法；新生母子分離、慢性束縛加番瀉葉灌胃法等；然而到目前為止還沒(méi)有公認(rèn)的理想的造模方法。本研究采用乙酸灌腸、夾尾激怒加束縛應(yīng)激的方法來(lái)制備肝郁脾虛型IBS大鼠模型。腸道灌注乙酸能模擬IBS腹痛及排便異常癥狀；夾尾激怒和束縛應(yīng)激不僅可以造成內(nèi)敏高壓性，也是模擬“肝郁脾虛證”最常采用的方法之一，符合“肝郁久犯脾，可導(dǎo)致脾虛”的情志致病理論。采用乙酸灌腸、夾尾激怒加束縛應(yīng)激的方法建立的肝郁脾虛型IBS大鼠模型，表現(xiàn)出高內(nèi)臟敏感性、抑郁和肝郁脾虛等多種特征，能很好地復(fù)制肝郁脾虛型IBS的臨床癥狀[19-22]。

本研究建立了肝郁脾虛型IBS大鼠模型，可從以下3個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。(l)行為學(xué)評(píng)價(jià)：造模期間，模型組較空白組淡漠，扎堆，嗜睡；毛發(fā)蓬亂，大便稀，肛門周圍臟；納呆少食，身體質(zhì)量下降。(2)IBS病的評(píng)價(jià)：內(nèi)臟高敏感是造成腹部癥狀的主要原因，內(nèi)臟敏感性增加是肝郁脾虛型IBS大鼠模型是否成功建立的關(guān)鍵指標(biāo)。而模型組大鼠動(dòng)物腹部回縮反射評(píng)分增加，表明其內(nèi)臟敏感性增加。(3)肝郁脾虛證的評(píng)價(jià)：采用曠場(chǎng)行為學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)肝郁脾虛證的建立，模型組大鼠的曠場(chǎng)總行為次數(shù)和修飾次數(shù)均明顯減少，表現(xiàn)出抑郁狀態(tài)。從結(jié)果可見(jiàn)，模型大鼠具有肝郁脾虛和抑郁等中醫(yī)癥候，本實(shí)驗(yàn)造模成功。

枳芍散由枳實(shí)芍藥二味組成，枳實(shí)通氣消食，可治氣滯之脹痛；芍藥補(bǔ)脾養(yǎng)肝，可治虛性腹痛；二者配伍，可走可守，攻補(bǔ)兼施。據(jù)報(bào)道，枳實(shí)具有調(diào)節(jié)胃腸蠕動(dòng)、中樞鎮(zhèn)痛等作用；芍藥具有保肝、鎮(zhèn)痛、抗抑郁等作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，枳實(shí)-白芍藥對(duì)對(duì)肝郁脾虛型IBS模型大鼠有較好的治療作用，藥效學(xué)評(píng)價(jià)如下：(l)枳芍藥對(duì)組AWR評(píng)分降低，能夠改善模型大鼠的腸道敏感性；(2)增加模型大鼠的自發(fā)行為，產(chǎn)生抗抑郁作用；(3)對(duì)醋酸等化學(xué)因素導(dǎo)致的疼痛具有抑制作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)枳實(shí)-白芍藥對(duì)能協(xié)同增強(qiáng)其治療肝郁脾虛型IBS模型大鼠的作用，且枳實(shí)-白芍1:1為最佳的藥效配伍比例，這也和古方枳芍散(來(lái)源于《金匱要略》)中的比例吻合，為發(fā)揮枳實(shí)-白芍藥對(duì)治療肝郁脾虛型IBS的療效及其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。