高效富集肺癌及癌旁組織轉(zhuǎn)錄因子的技術(shù)-catTFRE

謝輝 陳振崗 史學(xué)軍 鄧增華 孫長青 王輝 李一鳴 秦鈞 王廣舜

肺癌作為一種發(fā)病率和死亡高居世界第二，在中國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，已經(jīng)嚴(yán)重影響到人類的生命健康[1-2]。中國國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，2014年全國惡性腫瘤估計新發(fā)病例380.4萬，死亡病例229.6萬例，其中肺癌每年發(fā)病約78.1萬，死亡病例62.6萬例，均位居全國首位[3]。2000-2014年全球癌癥生存率變化趨勢監(jiān)測研究報告(CONCORD-3)顯示，中國肺癌的發(fā)病占所有癌癥的22.6%，而5年生存率僅19.8%[4]。雖然針對肺癌的研究一直在持續(xù)進(jìn)行，但進(jìn)展很難令人滿意。繼靶向治療后，隨著CAR-T[5-6]細(xì)胞治療及PD1/PD-L1抑制劑[7-8]的橫空出世，免疫治療極大的改變了癌癥科研和治療的理念，為肺癌的治療帶來了新的革命性進(jìn)展，但免疫治療尚處于高速發(fā)展階段，很多技術(shù)環(huán)節(jié)仍有待細(xì)化與改進(jìn)，有效率較低(約20%)、優(yōu)勢人群還不很明確、免疫相關(guān)不良事件(immune-related adverse events, irAE)等[9-10]問題仍需要進(jìn)一步全面認(rèn)識。近期由吳一龍教授牽頭的全國多中心隨機(jī)對照Ⅱ期臨床研究[11]：新輔助靶向治療對比化療的頭對頭研究(CTONG1103)結(jié)果發(fā)表在J Clin Oncol雜志上，研究顯示術(shù)前應(yīng)用靶向藥物(厄洛替尼)，有效率高于化療約20%，手術(shù)成功率提高約15%，并且降低了術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險，中位無進(jìn)展生存期(median progression-free survival, mPFS)提高了10個月，首次證實了EGFR-TKI在新輔助及輔助階段的應(yīng)用，但總體而言，如客觀緩解率(objective response rate, ORR)等獲益并未達(dá)到預(yù)期。新的方向的研究仍迫在眉睫。

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)作為與DNA特異性結(jié)合并調(diào)控轉(zhuǎn)錄功能的蛋白質(zhì)家族，幾乎所有的生物過程，都是由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)系統(tǒng)調(diào)控的[12]。多種疾病的發(fā)生就是源于一個調(diào)控體系的失調(diào)，研究發(fā)現(xiàn)[13]164個TF直接與277種疾病或癥狀相關(guān)聯(lián)。許多TF在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的過程中就起到關(guān)鍵作用，如轉(zhuǎn)錄因子EGFR，KRAS，HER2等。所以，基于目前肺癌的高發(fā)病率、高死亡率及TF在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中所起關(guān)鍵作用，在轉(zhuǎn)錄水平上研究肺癌組織與癌旁組織中TF的差異表達(dá)，可能對肺癌發(fā)病機(jī)制、早期診斷、轉(zhuǎn)移及治療有重要的指導(dǎo)意義。

鑒于TF作為核提取物(nuclear extract, NE)，其低豐度性[14]，將其從高豐度的蛋白質(zhì)中大規(guī)模鑒定出來一直是個難題。我們研發(fā)了基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的可以有效富集低豐度TF的檢測技術(shù)——catTFRE(a concatenated tandem array of the consensus transcription factor response elements，TF富集技術(shù))[14]，可以從細(xì)胞中大規(guī)模鑒定內(nèi)源性TF。但其在肺癌組織水平上對TF的富集效率如何還不得而知，本文首次利用catTFRE技術(shù)對肺癌及癌旁組織的TF進(jìn)行富集，并初步探討其調(diào)控的生物過程。

資料與方法

一、標(biāo)本和取材

來自天津醫(yī)科大學(xué)寶坻臨床學(xué)院腫瘤科病理證實的肺癌組織及癌旁組織6例。受試者均被告知組織標(biāo)本用于研究目的，知情同意。

二、生物素標(biāo)記的DNA(Biotin-DNA)的獲得

1 DNA 反應(yīng)元件的設(shè)計

根據(jù)已知高等脊椎動物的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合譜(http://jaspar.genereg.net/, The high-quality transcriptionfactor binding profile database)，人工合成串聯(lián)的結(jié)合序列，并將其構(gòu)入載體 pGEX4T2中。

2 體外擴(kuò)增DNA序列

通過人工合成生物素(biotin)標(biāo)記的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物，以構(gòu)建好的pGEX4T2-catTFRE為模板，經(jīng)PCR來擴(kuò)增目的產(chǎn)物片段。

3 瓊脂糖凝膠電泳及DNA回收

按照Gel Extraction Kit(快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒)的說明書進(jìn)行，得到Biotin-DNA。

三、組織樣本核蛋白的制備

肺癌組織及癌旁組織核提取物(NE)的提取按照從Thermo Scientific公司購買的“NE-PER?Nuclearand Cytoplasmic Extraction Reagents”試劑盒上的說明書進(jìn)行提取。提取完成之后用Bradford法[15]測定核蛋白的濃度。

四、轉(zhuǎn)錄因子的富集

使用catTFRE方法對組織樣本的TF進(jìn)行富集。每組樣品用3pmol(6μg)Biotin-DNA與120μL Dynal M280 鏈霉親和素磁珠結(jié)合后，再與600μg的組織核提取物結(jié)合，得到的protein-DNA復(fù)合物，然后洗去磁珠上非特異結(jié)合的蛋白，經(jīng)過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對富集的樣品進(jìn)行預(yù)分離，進(jìn)行膠內(nèi)酶解、肽段萃取，并將每組樣品合并為3個組份，經(jīng)60 ℃真空抽干，進(jìn)行質(zhì)譜分析及鑒定。

五、生物信息學(xué)分析

應(yīng)用基于強(qiáng)度的絕對定量方法(iBAQ)，依據(jù)組間 iBAQ值之間的比值對蛋白的表達(dá)量變化進(jìn)行評定[16]。對于鑒定到的發(fā)生變化的TF及蛋白，通過KEGG _Pathway Analysis進(jìn)行生物信息學(xué)分析。當(dāng)Student t-檢驗P<0.05 時，認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、catTFRE可高效富集肺癌及癌旁組織的轉(zhuǎn)錄因子

研究報道[13]TF的表達(dá)數(shù)量在組織類型之間變化很大，范圍從闌尾、皮膚約150種，到全腦、甲狀腺超過300種，其中肺的TF約270種。然而，所有表達(dá)基因相關(guān)的TF在所有樣本表達(dá)基因中的比例穩(wěn)定在6%左右[13,17]。由于富集的TF復(fù)合體以及相關(guān)蛋白的復(fù)雜程度較高，為提高TF的鑒定水平，我們通過傳統(tǒng)的SDS-PAGE，在蛋白水平對富集樣品進(jìn)行預(yù)分離，經(jīng)膠內(nèi)酶解和肽段萃取后為分3個組分進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。質(zhì)譜鑒定結(jié)果如下：肺癌組的質(zhì)譜掃描譜圖的平均利用率>50%，通過數(shù)據(jù)庫搜索，得到高可信度肽段數(shù)7369～10423，平均高可信度肽段數(shù)9916；鑒定到蛋白數(shù)為1256～1689，平均蛋白數(shù)1431種 (特異性肽段數(shù)量≥1)，含有轉(zhuǎn)錄因子193～264種，平均223種；癌旁組中，得到高可信度肽段數(shù)6984～9843，平均高可信度肽段數(shù)8756；鑒定到蛋白數(shù)為1236～1590，平均蛋白數(shù)1383種 (特異性肽段數(shù)量≥1)，含有轉(zhuǎn)錄因子182～207種，平均191種TF(見表1)。所富集到的TF包含了bZIP(Basic Leucine Zipper family)、ETS(E-twenty six)、HMG-box (High Mobility Group box family)、HLH(basic helix-loop-helix family)、FOX(Forkhead box family)、HOMEO(Homeobox family)、NHR(Nuclear hormone receptors family)、ZNF(Zinc finger family)以及p53 等各家族的TF。

表1 肺癌組織及癌旁組織轉(zhuǎn)錄因子鑒定對比

我們既往通過catTFRE對人類的HeLa、MCF-7及小鼠的Miliver等11個細(xì)胞系的TF進(jìn)行富集，每個細(xì)胞系在肽段萃取后分為12個組分，質(zhì)譜鑒定時間為16小時。檢測到單個細(xì)胞系的TF從207到460 種，平均290種[14]。同時，為了提高效率及節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本，本研究中組織樣品經(jīng)肽段萃取后僅分為3個組分，質(zhì)譜鑒定時間縮短為6小時，鑒定的TF基本上就可以達(dá)到細(xì)胞水平。此外，由于TF在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)豐度極低(僅占細(xì)胞總蛋白的0.001%～0.01% )[14]，而本研究中每組鑒定到的TF的總量(iBAQ)值約占每組鑒定到的蛋白總量的10%以上。說明catTFRE確實可以對癌及癌旁組織中的TF進(jìn)行有效富集。

二、差異表達(dá)蛋白及差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子

應(yīng)用基于強(qiáng)度的絕對定量方法(iBAQ)，對鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，依照兩組間iBAQ 值之間的比值對蛋白及TF的表達(dá)量變化進(jìn)行評定。肺癌組與癌旁組相比，表達(dá)上調(diào)的蛋白和TF(iBAQ 比值>3，同時鑒定到的肽段數(shù)>3個)分別有378種和有108(見表2)種，表達(dá)下調(diào)的蛋白和TF(iBAQ 比值小于0.33，同時鑒定到的肽段數(shù)>3個)分別有245種和50種(見表3)。

對于這些差異表達(dá)的TF，通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，有許多已經(jīng)被報道與肺癌或者與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。如UHRF1在多種癌癥中過表達(dá)，以其在維持DNMT1介導(dǎo)的DNA甲基化中的積極作用而聞名，并通過促進(jìn)細(xì)胞增殖及在癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[18]。有研究[19]指出FOXA1通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，在肺癌轉(zhuǎn)移的早期是一種重要的負(fù)性調(diào)節(jié)劑。NFATc1是一種調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成、T細(xì)胞發(fā)育和巨噬細(xì)胞功能的轉(zhuǎn)錄因子。通過以獨立于TGF-β信號傳導(dǎo)的方式上調(diào)轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail和Zeb1來抑制E-鈣粘蛋白表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[20]。這些差異表達(dá)的TF可能就是潛在的生物標(biāo)志物或可作為治療的靶點，也為接下來的大樣本和深入研究指明了一些方向。

三、差異表達(dá)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子的信號通路分析

為了對肺癌組織及癌旁組織的分子特征得到更進(jìn)一步的認(rèn)識，我們對組織中差異表達(dá)蛋白及TF調(diào)節(jié)的信號通路進(jìn)行了KEGG信號通路分析，結(jié)果顯示，這些差異的表達(dá)蛋白及TF，除了在細(xì)胞質(zhì)DNA感應(yīng)途徑(Cytosolic DNA-sensing pathway)、Notch信號傳導(dǎo)途徑(Notch signaling pathway)、核苷酸切除修復(fù)(Nucleotide excision repair)、錯配修復(fù)(Mismatch repair)、基底轉(zhuǎn)錄因子(Basal transcription factors)、剪切體(Spliceosome)明顯的富集現(xiàn)象之外，在VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)、細(xì)胞周期(Cell cycle)、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)(Transcriptional misregulation in cancer)等也有明顯的富集現(xiàn)象。對于上述信號通路，有些與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，有些被運用到抗腫瘤的策略中。如研究已證實VEGF信號通路參與腫瘤周圍新生內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖，在腫瘤周圍血管新生的過程中具有重要的作用。VEGF受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可作為抗腫瘤治療方案的理想靶點[21]。又如Notch信號通路是一條決定細(xì)胞命運、保守而重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響發(fā)育過程中多種細(xì)胞的分化、增殖和凋亡，研究發(fā)現(xiàn)其與肺癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[22]。TF在大多數(shù)人類癌細(xì)胞中過分活躍，這讓他們成為抗癌藥物的開發(fā)的目標(biāo)。研究差異表達(dá)蛋白及TF的信號通路，說明它們的確起著關(guān)鍵的作用，為未來深入的研究提供了一些重要的依據(jù)。

表2 上調(diào)TF

表3 下調(diào)TF

討 論

近年來隨著對肺癌研究的不斷深入，對其病因、發(fā)生發(fā)展、治療及預(yù)后知識不斷更新。除了形態(tài)學(xué)特征之外，近年來越來越多的研究致力于尋找能評估和預(yù)警肺癌術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的分子標(biāo)記物、篩選可以為肺癌個體化治療提供依據(jù)的靶點，與肺癌相關(guān)的分子生物學(xué)研究成為肺癌研究的熱點。

低豐度的TF中蘊含著豐富的與疾病相關(guān)的病理信息，通過確保特定基因的正確表達(dá)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)在控制許多生物過程中起著核心作用，但在樣品的處理過程中，由于與容器表面發(fā)生非特異性結(jié)合及其他溶劑的稀釋，低豐度的蛋白在分離和檢測前就已經(jīng)丟失，如何將其從高豐度的蛋白中分離出來并進(jìn)行鑒定一直是困擾著我們的一個問題。經(jīng)過不斷的嘗試與努力，我們研發(fā)的catTFRE技術(shù)，極大的提高了TF的富集效率及鑒定效率。本研究證實了在組織水平上catTFRE技術(shù)同樣可以高效富集和鑒定TF，為接下來大樣本、高數(shù)量鑒定肺癌組織的TF提供了技術(shù)支持。本研究還對差異表達(dá)的TF及蛋白做了KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)一些通路的確與一些腫瘤相關(guān)，而這些TF及相關(guān)通路可能就是我們未來研究的方向，或許我們可以從中找到肺癌發(fā)生發(fā)展甚至新的治療策略的突破口。

綜上所述，本研究提供的一種高效富集肺癌及癌旁組織轉(zhuǎn)錄因子的方法-catTFRE技術(shù)，并根據(jù)富集到的TF及蛋白復(fù)合物，對肺癌與癌旁組織差異表達(dá)TF和蛋白的分析，我們發(fā)現(xiàn)一些TF在肺癌的發(fā)生、發(fā)展的過程中起到調(diào)控作用，TF的表達(dá)變化，可能使一些與細(xì)胞生長、分裂和增殖有關(guān)的蛋白異常表達(dá)而導(dǎo)致增殖失控、凋亡受阻以及侵襲與轉(zhuǎn)移等，使細(xì)胞在整個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)上表現(xiàn)出與正常細(xì)胞的許多區(qū)別，最終引起肺癌的發(fā)生。通過對肺癌組織及癌旁組織TF的鑒定及分析研究，有助于解釋TF與肺癌發(fā)生之間的關(guān)系，為未來對大規(guī)模肺癌的深入研究提供一些重要的依據(jù)和基礎(chǔ)。