lncRNA TDRG1、miR-194-3p在直腸癌組織中的表達變化及其對直腸癌細胞凋亡和放療敏感性影響觀察

趙剛，武青生，趙延禮，馬生彪，王巍，穆元忠

1 青海省第五人民醫(yī)院，西寧810000；2 青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院

直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，根治性手術(shù)是臨床治療直腸癌的主要策略，但由于直腸解剖位置復(fù)雜，手術(shù)不易徹底清除，術(shù)后復(fù)發(fā)率高。為延長直腸癌患者的生存期，常常輔以放療。然而，由于部分患者出現(xiàn)放療抵抗，大大降低了放療效果。因此，探究如何減少放療抵抗，提高放射敏感性并促進腫瘤細胞凋亡具有重要意義。近年來多項研究[1]表明，長鏈非編碼RNA(lncRNA)異常表達與腫瘤細胞放療敏感性相關(guān)。研究[2]顯示，lncRNA睪丸發(fā)育相關(guān)基因1(TDRG1)在子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、精原細胞瘤等多種惡性腫瘤中表達上調(diào)，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和化療耐藥密切相關(guān)。但lncRNA TDRG1和放療敏感性的相關(guān)研究較少。本研究觀察了lncRNA TDRG1、微小RNA-194-3p(miR-194-3p)在直腸癌組織中的表達變化，及其對直腸癌細胞凋亡、放療敏感性的影響，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 直腸癌細胞和試劑 人直腸癌細胞系SW1643購自美國ATCC公司，Qiagen RNeasy Mini試劑盒、SYBR Green Master Mix購自杭州沃森生物技術(shù)有限公司，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、青鏈霉素溶液購自美國Gibco公司，PCR引物、lncRNA TDRG1小干擾RNA序列si-TDRG1及其對照si-NC、miR-194-3p mimics及其對照miR-NC、miR-194-3p抑制物anti-miR-194-3p及其對照anti-miR-NC購自上海英駿公司，膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒、放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解緩沖液購于上海碧云天生物公司；兔源B細胞淋巴瘤(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、山羊抗兔二抗購自美國CST公司，實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，流式細胞儀購自美國Beckman公司。

1.2 直腸癌組織和癌旁組織的收集及組織中l(wèi)ncRNA TDRG1、miR-194-3p檢測 本研究共收集30對直腸癌組織及與其對應(yīng)的癌旁組織(距離癌灶5 cm以上的腸壁組織)，樣本均經(jīng)標準程序進行手術(shù)切除，并經(jīng)病理學(xué)確診。所有樣本采集者均簽署知情同意書，并獲得醫(yī)院倫理委員會批準。采用RNeasy Mini試劑盒分別從直腸癌組織、癌旁組織中分離總RNA，利用ThermoScript RT-PCR系統(tǒng)將2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并利用SYBR Green Master Mix和roche Light Cycler 96進行定量PCR。引物序列如下：TDRG1上游引物為5′-TCTTCCCTGGCTTGGC-3′，下游引物為5′-TGGGCTCTTTCGTGGC-3′；miR-194-3p上游引物為5′-ACACTCCCAGUGGGGCUG-3′，下游引物為5′-CAGAUAACAGTTGAGAGTACAT-3′；GAPDH上游引物為5′-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′，下游引物為5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCG-3′。以U6和GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示組織中l(wèi)ncRNA TDRG1、miR-194-3p的相對表達量。

1.3 lncRNA TDRG1靶基因預(yù)測驗證 使用LncBase Predicted v.2在線預(yù)測網(wǎng)站分析lncRNA TDRG1的靶基因，發(fā)現(xiàn)lncRNA TDRG1的序列中含有與miR-194-3p互補的核苷酸序列，提示lncRNA TDRG1直接靶向miR-194-3p。采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞ClncRNA TDRG1的靶基因：構(gòu)建含有miR-194-3p結(jié)合位點的野生型熒光素酶報告基因載體WT-TDRG1、含有miR-194-3p結(jié)合位點突變序列的突變型熒光素酶報告基因載體MUT-TDRG1，將miR-194-3p mimics、miR-NC分別與WT-TDRG1、MUT-TDRG1共轉(zhuǎn)染至SW1643細胞，轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定熒光素酶活性。

1.4 細胞培養(yǎng)和實驗分組 SW1643細胞采用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)液置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。將對數(shù)生長期SW1643細胞按照2×105個/孔的細胞密度接種于6孔板，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑分別將si-TDRG1、si-NC、miR-194-3p mimics、miR-NC、si-TDRG1+anti-miR-194-3p、si-TDRG1+anti-miR-NC分別轉(zhuǎn)染SW1643細胞，分別記為si-TDRG1組、si-NC組、miR-194-3p組、miR-NC組、、si-TDRG1+anti-miR-194-3p組si-TDRG1+anti-miR-NC組，轉(zhuǎn)染48 h后檢測轉(zhuǎn)染效率，合格后進行后續(xù)實驗分析。

1.5 各組細胞凋亡率測算 采用流式細胞術(shù)。各組細胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞并重懸于結(jié)合緩沖液中，調(diào)整細胞密度為1×106個/mL。取100 μL細胞懸液，按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒使用說明，檢測各組細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=(早期凋亡數(shù)+晚期凋亡數(shù))/細胞總數(shù)×100%。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.6 各組細胞中Bcl-2、Bax蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組細胞，RIPA裂解緩沖液裂解細胞，獲得細胞蛋白。配置濃縮膠和分離膠，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞蛋白，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并在5%牛血清蛋白中于室溫封閉1 h。封閉后，將膜置于1∶1 000稀釋的Bcl-2、Bax、GAPDH抗體溶液中孵育1 h，TBST洗膜，將膜置于相應(yīng)的1∶1 000稀釋的二抗溶液中孵育1 h。采用增強的化學(xué)發(fā)光試劑盒進行顯影，Image J軟件進行光密度測定，以目的蛋白和GAPDH光密度值比值表示目的蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.7 各組細胞放療敏感性測算 采用克隆形成實驗。將各組細胞接種到6孔板，分別采用0、2、4、6、8 Gy劑量射線照射細胞，照射后將各組細胞置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)、甲醇固定、結(jié)晶紫染色，計數(shù)≥50個細胞的克隆數(shù)，計算細胞存活分數(shù)，并利用GraphPadPrism 5軟件繪制每個實驗的存活曲線，計算放射增敏比(SER)。SER是反應(yīng)放射敏感性的主要參數(shù)。SER>1表示放射敏感性增強，SER<1表示放射敏感性降低。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 直腸癌組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA TDRG1、miR-194-3p相對表達量比較 直腸癌組織中l(wèi)ncRNA TDRG1、miR-194-3p的相對表達量分別為3.15±0.33、0.58±0.05，癌旁組織中l(wèi)ncRNA TDRG1、miR-194-3p的相對表達量分別為1.01±0.08、1.00±0.09，兩者相比，P均<0.05。

2.2 lncRNA TDRG1靶基因驗證結(jié)果 轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-TDRG1、miR-194-3p mimics的SW1643細胞熒光素酶活性為0.36±0.04，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-TDRG1、miR-NC的SW1643細胞熒光素酶活性為1.00±0.09，兩者相比，P<0.05；轉(zhuǎn)染MUT-TDRG1、miR-194-3p mimics的SW1643細胞熒光素酶活性為1.01±0.09，轉(zhuǎn)染MUT-TDRG1、miR-NC的SW1643細胞熒光素酶活性為0.99±0.08，兩者相比，P>0.05。

2.3 各組細胞凋亡率比較 si-TDRG1組、si-NC組細胞凋亡率分別為22.14%±2.21%、6.98%±0.65%，兩組相比，P<0.05。miR-194-3p組、miR-NC組細胞凋亡率分別為19.65%±1.84%、7.12%±0.71%，兩組相比，P<0.05。si-TDRG1+anti-miR-194-3p組、si-TDRG1+anti-miR-NC組細胞凋亡率分別為13.47%±1.35%、23.34%±2.33%，兩組相比，P<0.05。

2.4 各組細胞中Bcl-2、Bax蛋白相對表達量比較 si-TDRG1組Bcl-2、Bax蛋白相對表達量分別為0.32±0.03、0.68±0.06，si-NC組Bcl-2、Bax蛋白相對表達量分別為0.72±0.07、0.23±0.03，兩組相比，P均<0.05。miR-194-3p組Bcl-2、Bax蛋白相對表達量分別為0.37±0.03、0.62±0.06，miR-NC組Bcl-2、Bax蛋白相對表達量分別為0.74±0.07、0.22±0.03，兩組相比，P均<0.05。si-TDRG1+anti-miR-194-3p組Bcl-2、Bax蛋白相對表達量分別為0.62±0.05、0.35±0.03，si-TDRG1+anti-miR-NC組Bcl-2、Bax蛋白相對表達量分別為0.31±0.03、0.69±0.05，兩組相比，P均<0.05。

2.5 各組細胞放療敏感性比較 si-TDRG1組、si-NC組細胞存活分數(shù)分別為0.330、0.657，SER為2.016。miR-194-3p組、miR-NC組細胞存活分數(shù)分別為0.370、0.669，SER為1.913。si-TDRG1+anti-miR-194-3p組、si-TDRG1+anti-miR-NC組細胞存活分數(shù)分別為0.547、0.320，SER為0.574。

3 討論

越來越多的研究[3，4]證實，許多l(xiāng)ncRNA在直腸癌發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。本研究通過RT-qPCR檢測證實，直腸癌組織中l(wèi)ncRNA TDRG1的表達較其鄰近正常組織顯著升高，并通過功能實驗證實lncRNA TDRG1在直腸癌中具有致癌因子作用，干擾lncRNA TDRG1表達可誘導(dǎo)直腸癌細胞SW1643凋亡、降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達、升高促凋亡蛋白Bax的表達水平，并提高其放療敏感性。與本研究結(jié)果類似，lncRNA TDRG1在宮頸癌、卵巢癌等惡性腫瘤中均發(fā)揮致癌作用。研究[5]顯示，宮頸癌組織和癌細胞中l(wèi)ncRNA TDRG1的表達明顯增加，其高表達促進宮頸癌細胞的增殖和遷移。lncRNA TDRG1高表達與精原細胞瘤的惡性生物學(xué)行為和腫瘤分期具有相關(guān)性，干擾lncRNA TDRG1表達可降低NTERA-2細胞增殖和侵襲能力，并提高其凋亡水平。此外，干擾lncRNA TDRG1表達還可提高精原細胞瘤TCam-2細胞對順鉑的化學(xué)敏感性[6]。以上研究說明，干擾lncRNA TDRG1表達可促進直腸癌細胞凋亡，并提高其放療敏感性。

研究[7]顯示，lncRNA中含有miRNA結(jié)合位點，可通過發(fā)揮miRNA海綿作用拮抗其功能。研究[5]發(fā)現(xiàn)，lncRNA TDRG1通過海綿作用拮抗miR-330-5p對ELK1的抑制作用，從而促進宮頸癌進展。為揭示TDRG1在直腸癌中的作用機制，采用生物信息學(xué)網(wǎng)站LncBase Predicted v.2在線預(yù)測miR-194-3p與lncRNA TDRG1之間存在潛在結(jié)合位點，隨后通過雙熒光素酶實驗確定miR-194-3p為lncRNA TDRG1在直腸癌細胞SW1643中的靶miRNA。先前研究[8]表明，miR-194-3p在膠質(zhì)瘤中具有抑癌因子作用，過表達miR-194-3p可抑制膠質(zhì)瘤細胞的干細胞特性。同時，過表達miR-194-3p還可增強鼻咽癌細胞放療敏感性和細胞凋亡，抑制細胞遷移、侵襲和增殖，并抑制裸鼠成瘤。此外，過表達miR-194-3p還可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖和遷移。本研究結(jié)果顯示，直腸癌組織中miR-194-3p呈低表達，且lncRNA TDRG1能負性調(diào)控miR-194-3p表達，于是推測miR-194-3p在直腸癌中具有抑癌作用。進一步功能實驗顯示，過表達miR-194-3p促進直腸癌細胞SW1643凋亡、抑制Bcl-2表達、促進Bax表達，并提高SW1643細胞放療敏感性。此外，抑制miR-194-3p表達可逆轉(zhuǎn)干擾lncRNA TDRG1對SW1643細胞凋亡和放療敏感性的影響。以上研究提示，lncRNA TDRG1通過靶向調(diào)控miR-194-3p影響直腸癌細胞的凋亡和放療敏感性。

綜上所述，直腸癌組織中l(wèi)ncRNA TDRG1高表達、miR-194-3p低表達；干擾lncRNA TDRG1表達和過表達miR-194-3p均可誘導(dǎo)直腸癌細胞SW1643凋亡、降低Bcl-2蛋白相對表達量、升高Bax蛋白相對表達量、增強放療敏感性；干擾miR-194-3p表達可逆轉(zhuǎn)干擾lncRNA TDRG1對SW1643細胞凋亡和放療敏感性的影響。干擾lncRNA TDRG1可能是通過靶向miR-194-3p促進直腸癌細胞凋亡，并提高其放療敏感性，lncRNA TDRG1有望成為提高直腸癌放療敏感性的治療靶點。