大腸埃希菌中細(xì)胞分裂抑制子的潛在調(diào)控基因篩選

劉健平，魯洋，曾建明,陳茶

1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣州510000；2 廣東省中醫(yī)院

1994年Fuque[1]首次提出群體感應(yīng)系統(tǒng)(QS)的概念，打開了細(xì)菌間通信機(jī)制研究的大門，QS系統(tǒng)已成為微生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。QS概念描述了細(xì)菌通過感知特定信號分子濃度以監(jiān)測環(huán)境中群體密度的變化，繼而進(jìn)行細(xì)菌間特定的交流，當(dāng)信號分子達(dá)到一定濃度閾值時，誘導(dǎo)菌體相關(guān)基因的表達(dá)來適應(yīng)環(huán)境中的變化。在革蘭氏陰性菌中，細(xì)菌通過自身合成并分泌特定的信號分子N-?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯(AHLs)與相應(yīng)的受體蛋白結(jié)合后形成復(fù)合物，在特定的基因啟動子序列處結(jié)合DNA，然后激活或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄。大腸埃希菌(E.coli)自身不合成AHLs，但含有AHLs受體細(xì)胞分裂抑制子(Sdi A)蛋白，可感應(yīng)并應(yīng)答其他細(xì)菌產(chǎn)生的群體信號分子。Sdi A蛋白最初僅被認(rèn)為是細(xì)胞分裂抑制因子，可抑制細(xì)胞分裂，后來發(fā)現(xiàn)Sdi A蛋白是大腸埃希菌惟一明確的QS系統(tǒng)受體蛋白，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，可調(diào)控自身多項(xiàng)生命活動[2]。目前研究[3～5]發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌群體感應(yīng)系統(tǒng)可介導(dǎo)細(xì)菌的耐酸性、毒力、運(yùn)動性、生物膜形成、耐藥性等多種生理過程。隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展和測序平臺建立的日趨完善，轉(zhuǎn)錄組測序可快速可靠地獲得物種在某一狀態(tài)下幾乎全部轉(zhuǎn)錄本及基因序列，再通過生物信息學(xué)工具抓取足夠的信息來對特定物種進(jìn)行分析，以推測其調(diào)控規(guī)律[6]。本研究為繼續(xù)尋找Sdi A蛋白調(diào)控細(xì)菌生命活動的可能機(jī)制，通過聯(lián)合E.coliSM10λpir野生株、E.coliSM10λpir Sdi A敲除株、E.coliSM10λpir Sdi A過表達(dá)回復(fù)株經(jīng)過有或無AHLs信號分子處理后收集菌液進(jìn)行測序，通過生物信息學(xué)方法分析各菌株基因表達(dá)的差異情況，綜合分析Sdi A的潛在調(diào)控基因，為后續(xù)進(jìn)一步揭示Sdi A蛋白的生物學(xué)功能及其調(diào)控生命活動的具體機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑 菌株E.coliSM10λpir野生株、E.coliSM10λpir Sdi A敲除株、E.coliSM10λpir Sdi A過表達(dá)回復(fù)株由本實(shí)驗(yàn)室保存，3-oxo-C12-HSL購自Sigma公司，C4-HSL購自Cayman公司，RNA提取試劑盒購自東盛公司。

1.2 菌株分組及處理 取E.coliSM10λpir野生株、E.coliSM10λpir Sdi A敲除株、E.coliSM10λpir Sdi A過表達(dá)回復(fù)株過夜菌液100 μL，分別接種到2支含3 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基玻璃試管中，分別記為非AHLs處理組和AHLs處理組。AHLs處理組中加入AHLs信號分子3-oxo-C12-HSL與C4-HSL的混合液，使其終濃度為20 μmol/L；非AHLs處理組加入等量DMSO。

1.3 差異表達(dá)基因的篩選方法 三種菌株經(jīng)37℃ 220 r/min震蕩培養(yǎng)4 h后收集菌液，用RNA抽提試劑盒提取細(xì)菌總RNA，置于-80℃保存，送廣州瑞科基因科技有限公司進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄組測序。轉(zhuǎn)錄組測序的原始數(shù)據(jù)經(jīng)trinity RNA-Seq(https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq)處理，然后通過R語言edgeR軟件包篩選差異表達(dá)基因，篩選條件：︱log2FC︱>1.5且P<0.05。

1.4 Sdi A潛在調(diào)控基因的篩選 ①無AHLs信號分子時Sdi A的潛在調(diào)控基因篩選。選取非AHLs處理組組內(nèi)E.coliSM10λpir Sdi A敲除株與E.coliSM10λpir野生株之間、E.coliSM10λpir Sdi A過表達(dá)回復(fù)株與E.coliSM10λpir Sdi A敲除株之間同時出現(xiàn)差異性表達(dá)的基因，即為無AHLs信號分子時Sdi A的潛在調(diào)控基因。②有AHLs信號分子時Sdi A的潛在調(diào)控基因篩選。選取AHLs處理組組內(nèi)E.coliSM10λpir Sdi A敲除株與E.coliSM10λpir野生株之間、E.coliSM10λpir Sdi A過表達(dá)回復(fù)株與E.coliSM10λpir Sdi A敲除株之間同時出現(xiàn)差異性表達(dá)的基因，即為有AHLs信號分子時Sdi A的潛在調(diào)控基因。③兩組Sdi A潛在調(diào)控基因比對。比對無AHLs信號分子時Sdi A的潛在調(diào)控基因、有AHLs信號分子時Sdi A的潛在調(diào)控基因，觀察有、無AHLs信號分子時Sdi A潛在調(diào)控基因的變化。

2 結(jié)果

2.1 無AHLs信號分子時Sdi A潛在調(diào)控基因的篩選結(jié)果 非AHLs處理組中，與E.coliSM10λpir野生株相比，E.coliSM10λpir Sdi A敲除株有14個基因出現(xiàn)差異性表達(dá)，其中8個基因表達(dá)上調(diào)，包括narH、narJ、narI、yeeE、cysW、iraD、yfaP、narG基因，6個基因表達(dá)下調(diào)，包括mhpE、paaE、yiaN、yeeS、yeeR、flu基因；與E.coliSM10λpir Sdi A敲除株比較，E.coliSM10λpir Sdi A過表達(dá)回復(fù)株有108個基因出現(xiàn)差異性表達(dá)，其中64個基因表達(dá)上調(diào)，包括nanC、nanM、nanS、yjhB、lacY、ssnA、flu、ygeW、nanT、dmlA、nanE、lacZ、ygfK、nanA、mglA、nanK、dctA、hycF、hdhA、sdhC、ygeY、ygeX、dsdX、yjhC、ygfM、hyaB、mglB、hycE、ydcI、hycG、cstA、xdhA、flgA、galS、dadA、yhcH、xdhD、hyaF、hyaA、uacT、sdhA、msrB、xdhB、xdhC、allC、allD、paaE、emrY、yjfN、sgrS、glpF、ydeN、melA、yeeR、hycH、yjiY、tdcB、glsA、uspC、fadH、hyaD、dsdA、hycD、hyuA基因，44個基因表達(dá)下調(diào)，包括nikD、endA、opgC、yjbI、nikR、sodA、yfcC、narK、guaB、aqpZ、nikC、nirB、yqeI、pyrD、nrfD、ybjE、nikA、yccM、nrfC、nrfE、yqeJ、wcaL、phoE、narH、hmp、rzpR、nrfF、mntP、nikB、narJ、ptsG、wcaG、dhaM、ycaK、ygbA、yhjX、narI、dhaL、hsdS、dhaK、ytfE、yeeE、hcr、hcp基因。由上可知，E.coliSM10λpir Sdi A敲除株與E.coliSM10λpir野生株之間、E.coliSM10λpir Sdi A過表達(dá)回復(fù)株與E.coliSM10λpir Sdi A敲除株之間同時出現(xiàn)差異性表達(dá)的基因?yàn)閚arH、narJ、narI、yeeE、yeeR、paaE、flu。其中，Sdi A基因敲除時，narH、narJ、narI、yeeE基因表達(dá)上調(diào)，yeeR、paaE、flu基因表達(dá)下調(diào)；而在Sdi A回復(fù)過表達(dá)后，上述基因表達(dá)趨勢相反，即narH、narJ、narI、yeeE基因表達(dá)下調(diào)，yeeR、paaE、flu基因表達(dá)上調(diào)，提示無AHLs信號分子時上述基因受到Sdi A的潛在調(diào)控。

2.2 有AHLs信號分子時Sdi A潛在調(diào)控基因的篩選結(jié)果 AHLs處理組中，與E.coliSM10λpir野生株相比，E.coliSM10λpir Sdi A敲除株有18個基因出現(xiàn)差異性表達(dá)，其中13個基因表達(dá)上調(diào)，包括hcp、ytfE、hcr、narI、fimI、fimF、fimC、narH、narJ、narG、fimD、hmp、fimA基因，5個基因表達(dá)下調(diào)，包括ydiV、gadW、hdhA、yeeR、flu；與E.coliSM10λpir Sdi A敲除株比較，E.coliSM10λpir Sdi A過表達(dá)回復(fù)株有91個基因出現(xiàn)差異性表達(dá)，其中55個基因表達(dá)上調(diào)，包括nanC、nanM、nanS、yjhB、lacY、flu、nanT、lacZ、nanE、hdhA、nanA、gadW、yhcH、dmlA、nanK、uacT、sdhC、mglB、ygeW、yjhC、ydiV、ygfK、sdhD、dadA、mglA、dctA、xylF、ssnA、ygeY、cstA、yciE、ygeX、ygfT、acrE、dgoA、sdhA、msrB、sdhB、yeeR、eutT、ynaJ、ybiA、mglC、ybcL、fliM、xdhA、allD、yjfJ、dsdX、xdhD、ygfM、fliF、hofN、galS、gltJ基因，36個基因表達(dá)下調(diào)，包括phoE、hypA、rpmE、nikB、mntP、purL、cvpA、ydiY、nikC、xanP、nrfD、nrfA、nrfC、narK、nrfG、ptsG、nrfB、purE、nikA、ygbA、nrfE、yccM、narH、wcaG、nrfF、narI、narJ、nirB、dhaL、hsdS、hmp、dhaK、dhaM、hcr、ytfE、hcp基因。由上可知，E.coliSM10λpir Sdi A敲除株與E.coliSM10λpir野生株之間、E.coliSM10λpir Sdi A過表達(dá)回復(fù)株與E.coliSM10λpir Sdi A敲除株之間同時出現(xiàn)差異性表達(dá)的基因?yàn)閔cp、ytfE、hcr、hmp、narH、narJ、narI、yeeE、yeeR、flu、ydiV、hdhA。其中，Sdi A基因敲除時，hcp、ytfE、hcr、hmp、narH、narJ、narI、yeeE基因表達(dá)上調(diào)，yeeR、flu、ydiV、hdhA基因表達(dá)下調(diào)；而在Sdi A回復(fù)過表達(dá)后，上述基因表達(dá)趨勢相反，即hcp、ytfE、hcr、hmp、narH、narJ、narI、yeeE基因表達(dá)下調(diào)，yeeR、flu、ydiV、hdhA基因表達(dá)上調(diào)，提示有AHLs信號分子時上述基因受到Sdi A的潛在調(diào)控。

2.3 兩組菌株中Sdi A潛在調(diào)控基因比對結(jié)果 narH、narJ、narI、yeeE、yeeR、flu基因在兩組菌株中均為Sdi A的潛在調(diào)控基因，hcp、ytfE、hcr、hmp、ydiV、hdhA基因僅在AHLs信號分子存在時為Sdi A的潛在調(diào)控基因。

3 討論

Sdi A作為重要的轉(zhuǎn)錄因子和大腸埃希菌中目前惟一明確的QS系統(tǒng)受體蛋白，參與細(xì)菌的多項(xiàng)生命活動，受到研究人員的強(qiáng)烈關(guān)注[7]。然而，盡管有關(guān)Sdi A的研究報道眾多，但由于研究模型和研究方法的差異，得到的結(jié)論不盡相同。近年來，隨著測序手段的成熟和各式分析工具的應(yīng)用，從測序結(jié)果中抓取重要的生物信息已被認(rèn)為十分可信，在微生物種群鑒定領(lǐng)域中已廣泛應(yīng)用。本研究通過敲除及過表達(dá)回復(fù)E.coliSM10λpir的Sdi A基因，在有或無AHLs信號分子時，利用RNA-seq測序技術(shù)獲得樣本轉(zhuǎn)錄組信息，篩選其中差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，使得我們獲取的信息具有全面性，又保證了結(jié)果的可靠性。通過比對AHLs處理組與非AHLs處理組中Sdi A潛在調(diào)控基因發(fā)現(xiàn)，無論是否有AHLs信號分子存在，narH、narJ、narI、yeeE、yeeR、flu基因的表達(dá)均受到Sdi A基因的調(diào)控，提示Sdi A潛在調(diào)控上述基因，且此調(diào)控不依賴AHLs信號分子。此外，hcp、ytfE、hcr、hmp、ydiV、hdhA基因僅在AHLs信號分子存在時出現(xiàn)表達(dá)變化，提示Sdi A對這幾個基因的調(diào)控依賴于AHLs信號分子的存在。

在大腸埃希菌中，narH、narG、narJ、narI基因編碼的硝酸還原酶復(fù)合體NarGHI是一種異三聚體復(fù)合鐵硫[Fe-S]鉬酸酶，包括含催化亞基的鉬輔因子(NarG)、含電子轉(zhuǎn)移亞基的[Fe-S]簇(NarH)和含血紅素的膜錨亞基(NarI)，它可在周質(zhì)的Q-位點(diǎn)氧化萘醌或泛醌，在細(xì)胞質(zhì)的鉬輔因子(雙鉬酸鹽鳥嘌呤二核苷酸，Mo-bisMGD)中還原硝酸鹽[8]。目前NarGHI復(fù)合體的研究報道甚少，其具體機(jī)制仍處于摸索階段。有報道[9]稱，NarGHI復(fù)合體可受環(huán)境因素的影響，但具體機(jī)制尚未明確。而作為QS系統(tǒng)的受體分子，Sdi A亦與環(huán)境因素密切相關(guān)，因此，NarGHI復(fù)合體受到Sdi A的調(diào)控不無道理。結(jié)合本研究測序結(jié)果，NarGHI復(fù)合體家族基因均受Sdi A的潛在調(diào)控，是Sdi A參與細(xì)菌硝酸鹽代謝有力證據(jù)。鑒于目前未有Sdi A參與調(diào)控NarGHI復(fù)合體或調(diào)控硝酸鹽代謝相關(guān)的研究報道，因此，進(jìn)一步深入研究二者的調(diào)控關(guān)系意義重大。另一方面，當(dāng)加入AHLs后，另一與硝酸鹽還原有關(guān)的基因hcp、hcr亦受到明顯影響，進(jìn)一步說明Sdi A與硝酸鹽代謝有密切關(guān)系。hcp、hcr基因受同一個操縱子調(diào)控，hcp編碼一種高親和力一氧化氮(NO)還原酶，是厭氧條件下將NO變成N2O的主要酶，hcr編碼一種NADH依賴的還原酶。研究[10]顯示，hcr保護(hù)hcp不被NO滅活，兩者聯(lián)合表達(dá)，保護(hù)多種細(xì)菌免受亞硝酸鹽的脅迫。hcp缺失將會導(dǎo)致細(xì)菌生長期間對NO極為敏感。研究[11]顯示，在厭氧環(huán)境中膜相關(guān)硝酸還原酶NarG表達(dá)上升，細(xì)菌還原亞硝酸鹽生成副產(chǎn)物NO增多，細(xì)菌為保護(hù)自身免受NO脅迫，上調(diào)表達(dá)hcp、hcr基因。大腸埃希菌黃血球蛋白(Hmp)是目前已知的NO解毒蛋白，具有很強(qiáng)的雙加氧酶活性，以氧為底物將NO轉(zhuǎn)化為硝酸根離子。通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)hmp基因表達(dá)合成Hmp是對NO及相關(guān)硝態(tài)氮脅迫的一種適應(yīng)性反應(yīng)，因此hmp是大腸埃希菌一種重要的保護(hù)機(jī)制，并且可能有助于腸致病性大腸埃希菌在腸道炎癥反應(yīng)期間的存活時間[12]。hcp與hmp同為硝酸鹽代謝相關(guān)基因，兩者存在一定的協(xié)同關(guān)系。近期研究[13]顯示，ytfE編碼YtfE蛋白，可作為鐵供體，參與修復(fù)被氧化和亞硝化條件破壞的含鐵硫酶活性所必需的蛋白質(zhì)，該基因的表達(dá)在AHLs的刺激下受到Sdi A的調(diào)控，可能與上述硝酸還原酶復(fù)合體NarGHI的表達(dá)變化有關(guān)。綜上所述，在本次測序結(jié)果中，NarGHI復(fù)合體基因、hcp、hcr、hmp、ytfE基因均受到Sdi A的潛在調(diào)控，多個靶基因指向Sdi A參與細(xì)菌硝酸鹽的代謝，在Sdi A缺失時，上述基因表達(dá)增強(qiáng)，提示Sdi A可能抑制上述基因的表達(dá)。人類體內(nèi)大腸埃希菌天然定植于腸道中，在這一厭氧環(huán)境下，大腸埃希菌可能通過調(diào)節(jié)Sdi A的表達(dá)量繼而調(diào)控自身硝酸鹽代謝，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

flu基因又名為Ag43基因，編碼Ag43蛋白，是大腸埃希菌中一種重要的外膜自轉(zhuǎn)運(yùn)體黏附蛋白。該蛋白受體不僅存在于人類靶細(xì)胞上，而且存在于細(xì)菌的表面，導(dǎo)致細(xì)菌相互黏附，并通過細(xì)菌自身聚集形成微菌落[14]。flu基因的缺失會干擾生物膜的形成[15]，其表達(dá)受到甲基化酶脫氧腺苷-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶(Dam)和氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)子OxyR的調(diào)控，OxyR作為flu基因表達(dá)的阻遏子，與Dam競爭結(jié)合flu啟動子區(qū)域?qū)崿F(xiàn)flu的抑制或表達(dá)[16]。研究[17,18]推斷環(huán)境信號可能影響Dam與OxyR的競爭結(jié)果，但目前具體的環(huán)境因素或調(diào)節(jié)子尚未明確。近期研究報道，Sdi A也是影響大腸埃希菌生物膜形成的重要分子，但flu是否介導(dǎo)Sdi A調(diào)控生物膜形成的研究尚未見報道，且Sdi A在調(diào)控flu表達(dá)過程中是否與Dam、OxyR具有協(xié)同或拮抗作用同樣有待進(jìn)一步探討。另一方面，yeeR、yeeE基因?yàn)橥粋€家族成員，是細(xì)胞膜的組成部分，yeeR與flu由同一個操縱子操控，在本次測序結(jié)果中共同受Sdi A的正向調(diào)控，而yeeE則呈反向調(diào)控，提示上述基因表達(dá)改變可能是影響細(xì)菌生物膜形成的又一因素。

大腸埃希菌中，ydiV基因編碼抗FLhD4C2因子，該因子在鞭毛基因表達(dá)水平上充當(dāng)營養(yǎng)條件的調(diào)節(jié)劑。研究[19]表明，在低營養(yǎng)條件下，通過多重質(zhì)粒過表達(dá)ydiV時，會減少鞭毛的產(chǎn)生和抑制大腸埃希菌的運(yùn)動性。ydiV基因在加入AHLs信號分子后出現(xiàn)差異性表達(dá)，正符合Sdi A通過感知環(huán)境調(diào)節(jié)自身基因表達(dá)的模式。雖然QS系統(tǒng)調(diào)控鞭毛的合成早有報道，但ydiV基因受QS系統(tǒng)調(diào)控卻是由本研究首次提出。

paaE基因編碼PaaE，是苯乙酰加單氧化酶A復(fù)合體(PA-CoA)的部分亞基。PaaE亞單位是一種選擇性NADPH和FAD的還原酶，其雙鐵中心可直接進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，還原細(xì)胞色素C，催化芳香環(huán)的氧化[20]。大腸埃希菌利用PA-CoA復(fù)合體來代謝苯乙酸(PA)。PA是一種環(huán)境污染物，大腸埃希菌可代謝PA進(jìn)而獲得碳源。根據(jù)測序結(jié)果，paaE的表達(dá)量與Sdi A的表達(dá)量呈正相關(guān)，可能是細(xì)菌感知環(huán)境PA聚積后作出的一系列反應(yīng)。

hdhA基因編碼7α-羥基甾體脫氫酶，其底物主要是酒精、葡萄糖、15-羥基前列腺素和羥類固醇等[21]。大腸埃希菌中，該酶可轉(zhuǎn)化膽汁，繼而獲得能量，但由于其研究甚少，具體的功能尚未被詳細(xì)報道。有研究[22]指出，在有氧條件下，環(huán)境滲透脅迫可誘導(dǎo)hdhA基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)增高。Sdi A作為環(huán)境的感受器，同時是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，在AHLs信號分子刺激下，參與hdhA基因的調(diào)控不無道理。

綜上所述，大腸埃希菌中Sdi A的潛在調(diào)控基因有narH、narJ、narI、yeeE、yeeR、flu、paaE、hcp、ytfE、hcr、hmp、ydiV、hdhA，其中對hcp、ytfE、hcr、hmp、ydiV、hdhA基因的調(diào)控依賴于AHLs信號分子，為下一步揭示Sdi A新的生物學(xué)功能打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。