腦膠質(zhì)瘤組織中差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析及腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)鍵調(diào)控基因篩選

鄭詩(shī)豪，陳忠儀，黃紹崧，劉宇清，黃繩躍

福建省立醫(yī)院，福州350001

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性高度惡性腫瘤，約占所有神經(jīng)腫瘤的30%，惡性腦腫瘤的80%[1]。根據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織(WHO)的指南，結(jié)合組織病理學(xué)和最新的分子生物學(xué)特征，腦膠質(zhì)瘤可劃分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)。腦膠質(zhì)瘤的治療方法主要包括手術(shù)切除、術(shù)后輔助放療和化療，但腦膠質(zhì)瘤的臨床治療效果仍不能令人滿意[2]。研究[3]顯示，惡性程度最高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中位生存期只有14個(gè)月。雖然與膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤相比，低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤表現(xiàn)出較為良性的生物學(xué)特性與較好的預(yù)后，但仍存在相當(dāng)高的復(fù)發(fā)率，并且隨著時(shí)間的推移，其惡性程度與WHO分級(jí)也相應(yīng)增加[4]。腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)因素和步驟，包括遺傳和表觀遺傳改變，盡管多種腦膠質(zhì)瘤的致癌機(jī)制已被證實(shí)，如p53和受體酪氨酸激酶信號(hào)通路等[5]，但我們對(duì)腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制仍知之甚少，因此與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要分子標(biāo)志物仍需進(jìn)一步探尋。本研究基于基因公共表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO數(shù)據(jù)庫(kù))，通過(guò)篩選出腦膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織之間的差異表達(dá)基因，采用生物信息學(xué)方法對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集、KEGG信號(hào)通路分析、關(guān)鍵調(diào)控基因篩選，為深入研究腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展提供新的基因靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 腦膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的選擇與獲取 從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇并下載編號(hào)為GSE2223的腦膠質(zhì)瘤表達(dá)譜芯片，該芯片基于GPL1833平臺(tái)SHFK檢測(cè)，由49例腦膠質(zhì)瘤以及4例人類正常腦組織樣本組成，提取該芯片中腦膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。49例腦膠質(zhì)瘤中包含31例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、2例毛細(xì)胞星形細(xì)胞瘤、1例低級(jí)別星形細(xì)胞瘤、1例間變型星形細(xì)胞瘤、8例少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、6例間變型少突星形細(xì)胞瘤。

1.2 腦膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織差異表達(dá)基因的提取與篩選 利用R語(yǔ)言將芯片中腦膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的表達(dá)強(qiáng)度歸一化，使得表達(dá)強(qiáng)度在一組陣列上具有相似的分布。利用R語(yǔ)言limma包，設(shè)置篩選條件為差異倍數(shù)>4倍且P<0.05(logFoldChange>2&adjustP<0.05)，篩選出芯片中腦膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織的差異表達(dá)基因。

1.3 差異表達(dá)基因的基因本體(GO)功能富集和KEGG信號(hào)通路分析 使用R語(yǔ)言的org.Hs.eg.db包對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集，包括差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分以及分子功能三個(gè)層面，取P<0.05且P值最顯著的前10個(gè)結(jié)果。利用DAVID 6.8在線分析網(wǎng)站對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因參與的KEGG信號(hào)通路分析，下載分析結(jié)果后應(yīng)用R語(yǔ)言ggplot2包按照P<0.05條件篩選出排名前10的信號(hào)通路。

1.4 腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)鍵調(diào)控基因的篩選 將篩選出的腦膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織差異表達(dá)基因?qū)隨TRING網(wǎng)站，構(gòu)建差異表達(dá)基因編碼的蛋白間相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)為蛋白間相互作用得分(interactionscore)>0.4，剔除無(wú)相互作用的孤立蛋白，整理成最后的PPI網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行可視化處理，根據(jù)蛋白間臨近相互作用對(duì)計(jì)數(shù)，選取前20個(gè)差異表達(dá)基因，即為可能參與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控基因。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織差異表達(dá)基因篩選結(jié)果 共篩選出107個(gè)差異表達(dá)基因，與正常腦組織相比，腦膠質(zhì)瘤組織中上調(diào)的基因48個(gè)、下調(diào)的基因59個(gè)。上調(diào)的基因?yàn)镻RRX1、GPR34、NES、TSKU、EHD4、CXCL16、ABCA1、NID1、PXDN、MTHFD2、SLCO2B1、LST1、TYROBP、VSIG4、TIMP4、ZNRD1-AS1、MST1L、S1PR3、MB、LILRB4、ITGA7、BBOX1、MAFB、RUNX1、CRISPLD1、SLAMF8、UHRF1、TCEB3、GATSL3、ID3、MS4A4A、MS4A6A、COL4A2、PLEK、CDKN1A、ITGA5、MS4A6E、SRGN、CCL11、KCNMB1、UBE2C、CLEC5A、IFI44L、TNFRSF12A、SOX4、SPOCD1、IL33、CLCF1。下調(diào)的基因?yàn)镠PCAL1、PNMAL2、PDE1B、MAL2、CAMK2A、CAP2、RAB3B、PHOX2B、PAK1、TMEM155、CAMK2B、ITPR1、MRAP2、RGS4、SNCG、CYP26A1、BCL11A、LINGO2、GABRA1、NUCB1、NRIP3、MAP7D2、HS6ST3、SNCA、KCNAB2、RAB27B、GDA、CAMKV、STXBP5L、RBFOX1、STXBP1、SULT4A1、RAB3A、VSTM2A、HPCAL4、CDK5R2、SOWAHA、CLEC2L、RYR2、FGF13、OSTM1-AS1、NAPB、SYP、FBXL16、L1CAM、MAST3、MARCKSL1、NEFL、CPLX2、PITPNM3、PHYHIP、INA、NRGN、TF、UBE2QL1、WBSCR17、LGI3、CACNG2、GAD2。

2.2 差異表達(dá)基因的GO功能富集和KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果 GO功能富集結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因在細(xì)胞組分上的改變主要表現(xiàn)在運(yùn)輸囊泡膜、神經(jīng)遠(yuǎn)端軸突、神經(jīng)軸突、突觸囊泡、突觸囊泡膜、運(yùn)輸囊泡膜等結(jié)構(gòu)上，分子功能變化主要集中在突觸融合蛋白、鈣調(diào)蛋白、磷脂酶結(jié)合蛋白、肌凝蛋白及突觸后的結(jié)構(gòu)等功能上；生物學(xué)過(guò)程體現(xiàn)在神經(jīng)遞質(zhì)分泌、運(yùn)輸及釋放、突觸囊泡周期的調(diào)節(jié)、神經(jīng)突觸跨突觸信號(hào)傳導(dǎo)等生物學(xué)過(guò)程上。KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因與腫瘤蛋白聚糖通路、催產(chǎn)素信號(hào)通路、胰島素分泌通路、鈣信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路等有關(guān)。

2.3 腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)鍵調(diào)控基因的篩選結(jié)果 構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)圖由136個(gè)節(jié)點(diǎn)、75個(gè)蛋白相互作用構(gòu)成,PPI網(wǎng)絡(luò)圖中蛋白間相互作用對(duì)數(shù)前20的差異表達(dá)基因分別為CAMK2A、CPLX2、SYP、RAB3A、GABRA1、TYROBP、CAMK2B、NEFL、STXBP1、VSIG4、GAD2、RBFOX1、HPCAL4、NRGN、PNMAL2、CDK5R2、LGI3、ABCA1、COL4A2，ITPR1，可能為參與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控基因。

3 討論

本研究挑選GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中編號(hào)為GSE2223的表達(dá)譜芯片，芯片數(shù)據(jù)由49例腦膠質(zhì)瘤腫瘤組織樣本、4例腦組織樣本組成，共篩選出107個(gè)差異表達(dá)基因，這些基因都可能與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，進(jìn)一步進(jìn)行GO功能富集和KEGG信號(hào)通路分析。GO功能富集結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤在細(xì)胞組分上的改變主要表現(xiàn)在神經(jīng)突觸、神經(jīng)軸突、突觸囊泡、突觸囊泡膜、運(yùn)輸囊泡膜上，分子功能變化主要集中在突觸融合蛋白、鈣調(diào)蛋白、磷脂酶、肌凝蛋白及突觸后的結(jié)構(gòu)上，生物學(xué)過(guò)程體現(xiàn)在神經(jīng)遞質(zhì)分泌、運(yùn)輸、傳遞以及神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)等變化。本研究中，GO功能富集結(jié)果的三個(gè)層面都一致提示腦膠質(zhì)瘤的進(jìn)展與神經(jīng)元活動(dòng)相關(guān)。在正常的腦組織中，神經(jīng)活動(dòng)誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)干細(xì)胞和祖細(xì)胞的增殖，并通過(guò)谷氨酸酰能的突觸引導(dǎo)他們的遷移[6,7]。Venkatesh和Venkataramani等[8,9]兩篇研究報(bào)告表明，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞上的神經(jīng)元過(guò)度興奮可刺激谷氨酸酰能突觸，進(jìn)而激活腫瘤細(xì)胞間鈣信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)多級(jí)細(xì)胞致癌信號(hào)級(jí)聯(lián)和細(xì)胞骨架重塑，從而促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力。Venkatesh等[10]認(rèn)為，神經(jīng)元活動(dòng)在腦膠質(zhì)瘤的增殖過(guò)程中起著重要作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)突觸黏附分子神經(jīng)膠質(zhì)素3可通過(guò)PI3K-mTOR通路促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的增殖。目前神經(jīng)活動(dòng)與腦膠質(zhì)瘤相關(guān)的研究仍鮮有報(bào)道，因此神經(jīng)元活動(dòng)在腦膠質(zhì)瘤中所起的作用值得進(jìn)一步探討和發(fā)現(xiàn)。

KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因參與介導(dǎo)了癌癥中蛋白聚糖通路、催產(chǎn)素信號(hào)通路、胰島素分泌通路、鈣信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路等多條信號(hào)通路。在癌癥中，蛋白聚糖可驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞中的多種致癌途徑，并在腫瘤微環(huán)境中起著重要作用。Wade等[11]提出蛋白聚糖激活了腫瘤細(xì)胞受體酪氨酸激酶信號(hào)通路，從而促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展。越來(lái)越多的證據(jù)[12]也表明，鈣可能是腦膠質(zhì)瘤中發(fā)生發(fā)展的重要正向調(diào)節(jié)因子，其作用涉及腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等功能。

本研究通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)一步篩選出影響腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的前20個(gè)關(guān)鍵調(diào)控基因，其中部分基因已在腦膠質(zhì)瘤中有相關(guān)研究報(bào)道，如RAB3A基因，它與正常大腦突觸囊泡的運(yùn)輸有關(guān)。KIM等[13]研究發(fā)現(xiàn)，RAB3A基因可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，并可促進(jìn)維持干性。WANG等[14]研究證實(shí)，miR-25和miR-183可靶向調(diào)控NEFL基因促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖。VSIG4基因已被發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和遷移，并且在腦膠質(zhì)瘤患者中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)VSIG4患者的預(yù)后不良。但本次篩選出的大部分關(guān)鍵調(diào)控基因目前在腦膠質(zhì)瘤中的研究較少，值得我們進(jìn)一步探究。

目前關(guān)于腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)研究成果正在逐漸應(yīng)用于臨床。2016年，WHO在腦膠質(zhì)瘤組織分型的基礎(chǔ)上增加了分子分型的分類，有力推動(dòng)了腦膠質(zhì)瘤的精準(zhǔn)診斷和治療的進(jìn)程。但是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展主要機(jī)制仍不明確，因此仍需在基因?qū)用嫔钊胩綄つX膠質(zhì)瘤發(fā)病的機(jī)理。本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中GSE2223芯片數(shù)據(jù)深入挖掘腦膠質(zhì)瘤的差異表達(dá)基因，通過(guò)GO功能富集和KEGG通路分析預(yù)測(cè)了其可能的發(fā)病機(jī)制，并構(gòu)建了差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，篩選了可能參與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控基因，初步揭示了腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的靶點(diǎn)、信號(hào)通路，為今后的基礎(chǔ)研究與臨床診治提供了新的思路和方向。