棉酚降解酶及熱帶假絲酵母ZD-3對(duì)棉籽粕脫毒的對(duì)比研究

楊文婷 陳 程 張文舉

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子832000）

由于我國(guó)畜牧業(yè)與飼料工業(yè)的快速發(fā)展，造成了飼料資源的緊缺，尤其是蛋白類飼料。飼用蛋白質(zhì)按原料來源可分為動(dòng)物性蛋白和植物性蛋白。但我國(guó)極其缺少如優(yōu)質(zhì)魚粉的動(dòng)物性蛋白資源，同時(shí)動(dòng)物性蛋白存在一定的安全隱患，所以人們對(duì)植物性蛋白原料的應(yīng)用給予越來越多關(guān)注。植物性蛋白不僅來源廣泛且價(jià)格低廉，主要有大豆粕、棉籽粕、菜籽粕、花生粕等。我國(guó)正是產(chǎn)棉大國(guó)，棉籽粕資源量排全球第一[1]。棉籽粕中粗蛋白的含量介于菜籽粕與豆粕之間[2]。它是一種優(yōu)質(zhì)的植物性蛋白飼料，但由于其含有的游離棉酚（Free gossypol，F(xiàn)G）這一抗?fàn)I養(yǎng)因子會(huì)對(duì)動(dòng)物體產(chǎn)生危害，當(dāng)動(dòng)物食用含有較高游離棉酚的棉粕飼料后，其生長(zhǎng)、繁殖都會(huì)受到很多不良的影響[3-5]，從而限制了它在動(dòng)物飼養(yǎng)上的廣泛應(yīng)用。目前研究最多的棉籽粕脫毒方法是固態(tài)微生物發(fā)酵，通常利用單菌或混合菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵[6-10]，被認(rèn)為是最安全有效的方法。其發(fā)酵過程中條件較為溫和[11]，經(jīng)發(fā)酵后，棉籽粕品質(zhì)有所改善[12-15]。目前，從酶學(xué)角度進(jìn)行棉酚酶解脫毒方法的研究尚未報(bào)道。本試驗(yàn)研究棉酚降解酶與熱帶假絲酵母ZD-3對(duì)棉籽粕中游離棉酚與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同影響，從而評(píng)定棉酚降解酶酶解棉籽粕的效果。本試驗(yàn)擬采用棉酚降解酶與熱帶假絲酵母ZD-3 分別對(duì)棉籽粕進(jìn)行酶解與固態(tài)發(fā)酵，對(duì)比研究棉酚降解酶與熱帶假絲酵母ZD-3 對(duì)棉籽粕中游離棉酚與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的影響，為評(píng)價(jià)棉酚降解酶酶解脫毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

棉籽粕，產(chǎn)自新疆石河子，粉碎，過40目篩，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。該未經(jīng)處理的原棉籽粕FG 含量為341.02 mg/kg，經(jīng)高溫高壓處理的棉籽粕FG 含量為89.63 mg/kg。

棉酚降解酶，由本實(shí)驗(yàn)室通過異源共表達(dá)棉鈴蟲細(xì)胞色素酶，獲取具有棉酚降解活性的酶蛋白，經(jīng)驗(yàn)證該酶蛋白作用于棉酚時(shí)，棉酚含量會(huì)顯著性下降，同時(shí)棉酚中間代謝物會(huì)加速降解，因此將該酶蛋白命名為棉酚降解酶。

棉酚降解酶酶活定義：l mg酶于30 ℃、pH值6條件下，每分鐘催化降解1 μmol 棉酚的量為一個(gè)酶活力單位，以U/mg 表示。以此酶活定義檢測(cè)甲醇誘導(dǎo)72 h的細(xì)胞破碎上清液蛋白濃度為1.05 mg/ml，酶活為230 U/mg[16-17]。

熱帶假絲酵母ZD-3為石河子大學(xué)飼料生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室選育保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子液制備

將熱帶假絲酵母ZD-3 接入YPD 固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h，挑取一環(huán)菌苔接入5 ml YPD 液體培養(yǎng)基，在試管中30 ℃，150 r/min 搖動(dòng)培養(yǎng)24 h(一級(jí)菌種)，培養(yǎng)時(shí)間主要根據(jù)菌種的生長(zhǎng)情況決定。取1.0 ml 一級(jí)菌種接入20 ml 液體培養(yǎng)基，在100 ml 三角瓶中30 ℃，150 r/min搖動(dòng)培養(yǎng)20 h(二級(jí)菌種)。

1.2.2 棉酚降解酶與熱帶假絲酵母菌對(duì)棉籽粕的脫毒效果

稱取粉碎后經(jīng)高溫高壓處理后的棉籽粕50 g 放入滅菌三角瓶中，分為棉酚降解酶組、熱帶假絲酵母ZD-3組，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、添加量（v/w）(即50 g棉籽粕添加2.5 ml棉酚降解酶或2.5 ml熱帶假絲酵母ZD-3 菌)、底物水分為脫毒的4 個(gè)因素，具體條件見表1，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)，以高溫高壓處理而未經(jīng)酶解和發(fā)酵的棉籽粕為對(duì)照組，以未經(jīng)任何處理的棉籽粕為棉籽粕組。試驗(yàn)結(jié)束后，將棉籽粕在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干48 h，溫度為60 ℃，粉碎，過60 目篩，備用。檢測(cè)游離棉酚含量、粗蛋白含量、粗灰分、酸溶性蛋白含量、中性洗滌纖維及棉籽粕蛋白分子質(zhì)量分布。

表1 試驗(yàn)各組脫毒條件

1.2.3 FG的測(cè)定

采用HPLC 高效液相色譜法測(cè)定FG 的含量，精確稱取棉籽粕或處理過的棉籽粕0.5 g，加入5 ml 70%丙酮室溫超聲波萃取30 min，每隔10 min上下翻動(dòng)一次，混合均勻。靜置后收集上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，以備上機(jī)檢測(cè)，具體試驗(yàn)條件參考陳程[16]方法。

脫毒率（%）=(原料中FG 含量-發(fā)酵后樣品中FG的含量)/原料中FG的含量×100

1.2.4 粗灰分、粗蛋白含量及中性洗滌纖維測(cè)定

參考張麗英[18]方法進(jìn)行粗灰分、粗蛋白含量及中性洗滌纖維的測(cè)定。

1.2.5 酸溶性蛋白的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取樣品0.5 g 于100 ml 燒杯中，準(zhǔn)確加入15%三氯乙酸溶液25 ml，混合均勻，靜置5 min。以中速定性濾紙過濾，棄去少許初始濾液，將濾液作為備用液。準(zhǔn)確移取其上清液10 ml 于消化管中，凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量[19]。

1.2.6 棉籽粕蛋白分子質(zhì)量分布的測(cè)定

將發(fā)酵前后的棉粕取0.5 g，加9.5 ml的蒸餾水混勻后用氨水調(diào)節(jié)pH值至10.5，過濾，4 000 r/min 離心20 min，加入等體積上樣緩沖液，水浴煮沸15 min。取20 μl 液體進(jìn)行點(diǎn)樣。聚丙烯酰胺變性凝膠電泳（SDS-PAGE）分析棉籽粗蛋白分子量的分布[16，20]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)測(cè)得的原始數(shù)據(jù)先采用Excel軟件進(jìn)行初步整理，后用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 棉籽粕中FG含量的變化(見表2)

如表2 所示，經(jīng)棉酚降解酶酶解后的棉籽粕，其FG的含量由341.02 mg/kg降到25.01 mg/kg，降解率達(dá)到92.67%；經(jīng)熱帶假絲酵母ZD-3 發(fā)酵后的棉籽粕，其FG 的含量由341.02 mg/kg 降到40.22 mg/kg，降解率為88.21%。相比于對(duì)照組73.72%的脫毒率，兩個(gè)試驗(yàn)組與其差異極顯著（P＜0.01），而兩個(gè)試驗(yàn)組之間差異不顯著（P＞0.05）。

表2 不同處理對(duì)棉籽粕中FG含量的影響

2.2 棉籽粕中營(yíng)養(yǎng)成分的變化(見表3)

表3 不同處理對(duì)棉籽粕中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的影響(%)

由表3 可知，棉酚降解酶組和熱帶假絲酵母ZD-3組的粗灰分和酸溶性蛋白相較于原棉籽粕與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）；兩個(gè)試驗(yàn)組的中性洗滌纖維與原棉籽粕差異不顯著（P＞0.05），與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）；棉酚降解酶組的粗蛋白含量與原棉籽粕、對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05），熱帶假絲酵母ZD-3 組的粗蛋白含量與原棉籽粕、對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)。而棉酚降解酶組與熱帶假絲酵母ZD-3組各個(gè)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 棉籽粕中棉籽粕蛋白分子質(zhì)量分布的變化

圖1 為不同處理棉籽粕中棉籽粕蛋白分子質(zhì)量分布，由圖1可知，SDS-PAGE分析結(jié)果表明未檢測(cè)到經(jīng)棉酚降解酶酶解及熱帶假絲酵母ZD-3發(fā)酵后的棉籽粕中大分子蛋白質(zhì)降解成小分子肽的現(xiàn)象。

3 討論

3.1 棉酚降解酶及熱帶假絲酵母ZD-3 對(duì)棉籽粕中FG含量的影響

當(dāng)前棉籽粕的脫毒主要利用微生物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，被認(rèn)為是最安全有效的方法。經(jīng)前人[6-10]研究能夠極顯著的降低棉籽粕底物中的游離棉酚，但微生物固態(tài)發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)，從而限制了效率。本試驗(yàn)采取不同處理進(jìn)行棉籽粕脫毒，結(jié)果表明，采用棉酚降解酶進(jìn)行棉籽粕酶解脫毒可以極顯著地降低游離棉酚含量，降解率達(dá)到92.67%，其脫毒效果與熱帶假絲酵母ZD-3 一致（88.21%），而棉酚降解酶酶解脫毒只需2 h，能夠極大地縮短時(shí)間。綜上所述，棉酚降解酶可以很好地替代熱帶假絲酵母ZD-3用于棉籽粕的脫毒中。

3.2 棉酚降解酶及熱帶假絲酵母ZD-3 對(duì)棉籽粕中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分的影響

營(yíng)養(yǎng)成分是評(píng)定棉籽粕質(zhì)量的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)的棉酚降解酶組及熱帶假絲酵母ZD-3組與對(duì)照組相比粗蛋白和酸溶性蛋白均有所提高，中性洗滌纖維和粗灰分有所降低。且棉酚降解酶組與熱帶假絲酵母ZD-3組相比差異不顯著（P＞0.05），因此，棉酚降解酶同熱帶假絲酵母ZD-3 一樣，可以提高酶解后棉籽粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善棉籽粕源飼料蛋白質(zhì)品質(zhì)，從而提高棉籽粕在飼料中的添加比例。

3.3 棉酚降解酶及熱帶假絲酵母ZD-3 對(duì)棉籽粕中蛋白分子質(zhì)量分布的影響

圖1 不同處理對(duì)棉籽粕中蛋白質(zhì)分子量的影響

賈曉鋒等[15]利用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵棉籽粕，發(fā)現(xiàn)可將高分子量的棉籽蛋白降解為小分子蛋白和肽；常磊[21]篩選出的芽孢桿菌ND-1，滅菌處理的棉籽粕固態(tài)發(fā)酵后，其大分子蛋白質(zhì)基本可以得到全部降解。這一變化可能是由于試驗(yàn)所用的黑曲霉及芽孢桿菌ND-1 可以分泌能夠降解棉籽粕蛋白的蛋白酶，使棉籽粕中的大分子蛋白質(zhì)降解成小分子肽類物質(zhì)。而經(jīng)檢測(cè)本試驗(yàn)的兩個(gè)試驗(yàn)組及滅菌未發(fā)酵棉籽粕，均未發(fā)現(xiàn)有大分子蛋白質(zhì)降解為小分子蛋白質(zhì)，以上結(jié)果說明棉酚降解酶和熱帶假絲酵母ZD-3不具有蛋白酶降解功能。

4 結(jié)論

經(jīng)過研究比較了棉酚降解酶和熱帶假絲酵母ZD-3 對(duì)棉籽粕脫毒的效果，可知由本實(shí)驗(yàn)室異源共表達(dá)的棉鈴蟲棉酚降解酶能夠有效的降解游離棉酚，提高棉籽粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。結(jié)果表明：棉酚降解酶對(duì)棉籽粕中FG 的降解率達(dá)到92.67%，高于熱帶假絲酵母ZD-3 發(fā)酵后的脫毒率。因此，棉酚降解酶酶解脫毒棉籽粕能夠替代熱帶假絲酵母ZD-3 固態(tài)發(fā)酵方法，同時(shí)相較于熱帶假絲酵母ZD-3 發(fā)酵48 h，棉酚降解酶酶解只需2 h，能夠極大地縮短脫毒時(shí)間，大大提高了棉籽粕脫毒效率。