牛磺酸對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠傷口愈合的影響

李 偉，姜玉新，陸曉華，王國光

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.病理生理學(xué)教研室；2.生理學(xué)教研室；3.機(jī)能實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心，安徽 蕪湖 241002)

糖尿病是嚴(yán)重的慢性代謝性疾病，糖尿病足潰瘍是糖尿病最嚴(yán)重的血管并發(fā)癥之一，糖尿病血管病變易引起下肢缺血，導(dǎo)致下肢創(chuàng)面感染和神經(jīng)病變，進(jìn)而導(dǎo)致足潰瘍的發(fā)生[1-2]。糖尿病足潰瘍嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，給患者家庭和社會(huì)帶來負(fù)擔(dān)。因此，尋找有效的足潰瘍治療方法有重要的臨床意義。牛磺酸是人體內(nèi)含量最多的非蛋白氨基酸，可改善糖尿病大鼠的心肌損傷[3]，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、改善脂質(zhì)代謝以及抗氧化抗炎等作用[4]。本研究旨在探討牛磺酸對(duì)糖尿病大鼠傷口愈合的影響及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與器材 ?；撬豳徸阅暇┙ǔ缮锕こ萄芯克?；鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)為Sigma公司產(chǎn)品；血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與血小板衍化生長因子(platelet derived growth factor，PDGF) ELSA檢測(cè)試劑盒購自合肥博美生物工程有限公司；β-actin、VEGF、VEGF受體(VEGF receptor，VEGFR)、p-VEGFR、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、p-ERK、蛋白激酶B( protein kinase B，Akt/PKB)及p-Akt多克隆抗體購自上海生物工程有限公司。

1.2 糖尿病模型復(fù)制及分組

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 雄性SD大鼠(體質(zhì)量200～240 g)購自南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)(許可證號(hào)：SCKK2013.0001)。在1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，以腹腔注射STZ70 mg/kg，3 d后，尾靜脈采血測(cè)定大鼠空腹血糖，血糖值超過16.7 mmol/L的為糖尿病大鼠。取16只糖尿病大鼠隨機(jī)均分為模型組(MOD，8只)及?；撬崽幚斫M(TAU，8只)，健康大鼠為對(duì)照組(CON，8只)。

1.2.2 糖尿病傷口的制備 在造模后兩周，大鼠以水合氯醛(10%，0.3 mL/kg)麻醉，剔除后背部毛發(fā)，剪切一深至筋膜直徑為2 cm的圓形切口。牛磺酸處理組大鼠灌胃給予?；撬?100 mg/kg)，輔以傷口?；撬彳浉嗵幚?。對(duì)照組及模型組大鼠以凡士林處理傷口。

1.2.3 傷口愈合觀察 每天觀察傷口的一般狀況及愈合情況。并于5、10、15及20 d測(cè)量計(jì)算傷口創(chuàng)面的愈合率。21 d后處死大鼠，收集血樣品及創(chuàng)面的肉芽組織。

傷口愈合率(%)=(傷口初始面積-測(cè)量面積)/傷口初始面積×100%。

1.2.4 血管生成因子的測(cè)定 血樣品離心分離血清，以ELISA試劑盒檢測(cè)血清中VEGF和PDGF水平，嚴(yán)格遵循試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 傷口肉芽組織的形態(tài)學(xué)觀察 創(chuàng)面肉芽組織以4%的甲醛固定，以石蠟包埋，切5 μm切片。蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin，H-E)染色觀察肉芽組織的形態(tài)學(xué)變化，并觀察小血管形成情況；馬松三色法(Masson trichrome)染色觀察膠原及肉芽組織厚度。

1.2.6 肉芽組織蛋白表達(dá)分析 創(chuàng)面肉芽組織置于預(yù)冷的裂解液中勻漿裂解，在4 ℃下以12 500 g離心20 min。上清液蛋白定量、變性后，在10%SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜。用5%的脫脂奶粉液封閉，分別加β-actin、VEGF、VEGFR、p-VEGFR、ERK、p-ERK、Akt及p-Akt抗體，4℃雜交過夜。洗膜后，與二抗孵育雜交2 h。蛋白印跡以DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1 牛磺酸對(duì)糖尿病大鼠傷口愈合的影響 結(jié)果顯示，在第5天之后，大鼠創(chuàng)面有肉芽組織形成，糖尿病組大鼠創(chuàng)面愈合速率較對(duì)照組低(P<0.01)，?；撬崽幚韯t加快創(chuàng)面的愈合(P<0.01)(表1)。

Groups給藥5 d給藥10 d給藥15 d給藥20 dCON13.99±2.3539.44±7.2473.06±8.9791.59±4.99MOD8.03±2.02??25.48±5.13??46.38±7.45??72.18±9.36??TAU10.59±1.66##32.81±5.27##61.54±5.84##84.03±5.04##F時(shí)間=665.110,P時(shí)間=0.000;F組別=61.554,P組別=0.000;F組別×?xí)r間=4.415,P組別×?xí)r間=0.001

**P<0.01vs. CON；##P<0.01vs. MOD。

2.2 ?；撬釋?duì)血清VEGF及PDGF水平的影響 糖尿病組大鼠血清VEGF及PDGF水平低于對(duì)照組(P<0.01)；?；撬嶂委熖岣叽笫笱錠EGF及PDGF水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

GroupsVEGF/(ng/L)PDGF/(ng/L)CON456.61±82.07386.91±52.39MOD331.84±66.26??296.33±45.42??TAU410.51±56.75#363.99±42.71##F6.6598.027P0.0060.003

**P<0.01vs. CON；#P<0.05，##P<0.01vs. MOD。

2.3 創(chuàng)面形態(tài)學(xué)變化 在切口形成初期，各組大鼠傷口均有炎癥出現(xiàn)，糖尿病組大鼠傷口炎癥較為嚴(yán)重，且傷口有膿液形成；進(jìn)一步的組織學(xué)觀察顯示，糖尿病組大鼠的傷口組織有炎癥細(xì)胞浸潤，組織中膠原排列不規(guī)則且較為疏松，?；撬嶂委熌芨纳苿?chuàng)面組織中膠原的排列(圖1)。

A：H-E染色(400×)，B：H-E染色(1000×)，C：Masson染色(1000×)。

圖1 牛磺酸對(duì)糖尿病大鼠創(chuàng)面形態(tài)的影響

2.4 ?；撬釋?duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 糖尿病大鼠肉芽組織中VEGF的表達(dá)低于對(duì)照組，并且肉芽組織中VEGFR、ERK及Akt的磷酸化水平降低(P<0.01)；?；撬嶂委熢黾尤庋拷M織中VEGF表達(dá)，并提高組織中VEGFR、ERK和Akt的磷酸化水平(P<0.01)(圖2，表3)。

圖2 各組大鼠血管形成信號(hào)Western blot圖

GroupsVEGF/β-actinp-VEGFR/VEGFRp-ERK/ERKp-Akt/AktCON1.24±0.140.51±0.081.18±0.070.52±0.08MOD0.42±0.06??0.22±0.05??0.42±0.07??0.24±0.04??TAU1.28±0.08##0.41±0.02##0.99±0.09##0.43±0.04##F143.27042.000157.30838.313P0.0000.0000.0000.000

**P<0.01vs. CON；##P<0.01vs. MOD。

3 討論

糖尿病血管病變是糖尿病并發(fā)癥如糖尿病腎病、心肌病及視網(wǎng)膜病變的病理基礎(chǔ)，也是糖尿病致死和致殘的重要因素。糖尿病足潰瘍是糖尿病外周血管病變而導(dǎo)致的糖尿病最為嚴(yán)重的并發(fā)癥。糖尿病足潰瘍由于其難于治療，往往導(dǎo)致截肢而使患者致殘，而截肢患者5年的致死率高達(dá)70%，嚴(yán)重影響到患者的生活質(zhì)量，并給患者家庭及社會(huì)帶來極大的負(fù)擔(dān)[5]。因此，糖尿病潰瘍已成為臨床醫(yī)學(xué)亟待解決的難題。

大量研究證實(shí)，外周血管病變引起下肢缺血易于導(dǎo)致潰瘍，進(jìn)而在潰瘍面產(chǎn)生感染，嚴(yán)重缺血時(shí)可在潰瘍區(qū)形成壞疽[6]。促進(jìn)血管的形成提高傷口的血液供給，有利于創(chuàng)面肉芽的形成，加速傷口愈合。促血管生成因子在調(diào)節(jié)血管形成中起著重要作用，研究證實(shí)，持續(xù)的高血糖降低促血管生成因子VEGF的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)促血管因子可加快糖尿病潰瘍創(chuàng)面的愈合[7-8]。本文對(duì)大鼠傷口愈合率的計(jì)算顯示，對(duì)照組及?；撬嶂委熃M大鼠傷口在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)基本愈合，而糖尿病組則未能愈合，表明?；撬峋哂写龠M(jìn)糖尿病大鼠傷口愈合的作用。同時(shí)研究還證實(shí)糖尿病大鼠血清促血管生成因子VEGF及PDGF降低，創(chuàng)面肉芽組織中小血管數(shù)及VEGF的表達(dá)均降低，而?；撬嶂委熆商岣哐錠EGF及PDGF水平及肉芽組織中小血管數(shù)量，增加VEGF在創(chuàng)面中的表達(dá)。

關(guān)鍵促血管生成因子如VEGF在血管形成中起著重要的作用，其在傷口治療的實(shí)驗(yàn)研究中也表現(xiàn)出促進(jìn)傷口愈合，然而只顯示出短期效應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)是血管形成信號(hào)的改變抑制糖尿病傷口的愈合，而不是細(xì)胞因子的表達(dá)阻礙血管形成[9-10]。Akt和ERK是調(diào)節(jié)血管形成信號(hào)的關(guān)鍵酶，它們通過磷酸化而被激活，激活的Akt和ERK可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖及存活，并激活促進(jìn)血管形成的重要酶如一氧化氮合酶[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，?；撬嶂委熆商岣邆谌庋拷M織中Akt和ERK的磷酸化水平。

本研究結(jié)果表明，?；撬峥商岣咛悄虿〈笫笱宕傺苌梢蜃覸EGF及PDGF水平，增加肉芽組織VEGF的表達(dá)，并提高組織中VEGFR、Akt和ERK的磷酸化水平，從而促進(jìn)肉芽組織血管形成，加快糖尿病大鼠皮膚傷口的愈合。