人參內生假單胞菌G13476分離篩選及其抗腫瘤效果研究

鞠鑫 錢瑋 胡翠英 馬雪香 王桃云 郭偉強

摘要?[目的]從人參中找尋具有抗腫瘤活性的內生菌，并研究其抗腫瘤效果和機制。[方法]使用假單胞菌基礎培養(yǎng)基進行分離，通過16s rDNA分子鑒定，采用MTT比色法、western blot等在乳腺癌細胞MDA-MB-231胞系中檢測抗腫瘤活性。[結果]所分離菌株G13476經(jīng)BLAST比對，確定其為假單胞菌;MTT數(shù)據(jù)和western blot結果顯示，菌株G13476通過下調Bcl-2、上調Bax實現(xiàn)對三陰性乳腺癌的抑制。[結論]該研究結果為人參內生假單胞菌G13476在抗腫瘤藥物的開發(fā)和應用提供技術支撐和理論基礎。

關鍵詞?人參;內生菌;假單胞菌;分離篩選;抗腫瘤;三陰性乳腺癌

中圖分類號?R?284文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）23-0193-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.23.056

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Isolation and Anti?tumor Effect of Endophytic Pseudomonad G13476 in Ginseng

JU Xin，QIAN Wei，HU Cui?ying et al?（School of Chemistry，Biology and Material Engineering，Suzhou University of Science and Technology，Suzhou，Jiangsu 215009）

Abstract?[Objective]The research aimed to find endophytic bacteria with anti?tumor activity from ginseng and study its anti?tumor effect and mechanism.[Method]Pseudomonas basal culture medium was used for isolation，molecular identification was analyzed by 16s rDNA，the anti?tumor effect and mechanism were measured by MTT assay and western blot in MDA?MB?231 cells.[Result]The isolated strain G13476 was aligned by BLAST to determine that it was pseudomonas;MTT data and western blot results showed that strain G13476 inhibited triple?negative breast cancer by down?regulating Bcl?2 and up?regulating Bax.[Conclusion]The results of this study provide technical support and theoretical basis for the development and application of anti?tumor drugs by pseudostellaria genus G13476.

Key words?Ginseng;Endophytic bacteria;Pseudomonad;Isolation and screening;Anti?tumor;Triple?negative breast cancer

癌癥嚴重危害人民群眾身體健康，如肺癌、肝癌、乳腺癌等。乳腺癌是十大惡性腫瘤之一，尤以三陰性乳腺癌危害更重[1]。目前，三陰性乳腺癌因缺少合適的治療靶點，致使治療效果差、死亡率高[2]。因此，找尋新的抗癌藥物一直是研究熱點和重點。

人參，屬五加科植物，在我國有數(shù)千年的藥用歷史，是傳統(tǒng)名貴藥材。人參具有調氣血、安精神、止驚悸等功效。近年來，現(xiàn)代藥理擴大人參的應用范圍和價值，研究發(fā)現(xiàn)人參具有抗腫瘤、抗炎癥、抑菌等作用[3-4]。人參皂苷Rg1通過抑制AMPK/mTOR/PI3K通路減少血管緊張素Ⅱ誘導足細胞的自噬現(xiàn)象[5];人參皂苷Rg3下調胰島素一號增長因子的分泌，實現(xiàn)對骨髓瘤細胞的增殖抑制[6];人參皂苷Re在人永生化表皮細胞HaCaT中，能夠調控絲蛋白和半胱天冬酶-14（caspase-14）促進皮膚的保護功能[7];人參皂苷Rh2在結腸癌荷鼠抑制瘤模型中能夠減輕腫瘤相關抑郁癥狀[8]。

內生菌（endophyte）是一類可在植物體內生存的微生物，且對宿主植物友好，不造成任何傷害。內生菌因其次生代謝產物中可能含有與宿主植物相同或相似的活性成分，而成為研究的熱點和重點[9]。因此，筆者研究從人參內生菌中分離的一株假單胞菌在乳腺癌細胞系MDA-MB-231中的抗腫瘤活性和潛在作用機制，以期為以該菌為基礎開發(fā)新型抗腫瘤藥物提供理論依據(jù)和試驗支撐。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

新鮮人參購自安徽亳州中藥市場;MDA-MB-231細胞株為蘇州科技生物實驗中心保存;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司;細菌總DNA提取試劑盒、Taq酶購自天根生化科技（北京）有限公司;引物合成、基因測序由生工生物工程（上海）有限公司完成。蛋白胨、牛肉粉、氯化鈉、乙酸乙酯等試劑購自國藥集團。

假單胞菌基礎培養(yǎng)基：明膠胨 16.0 g、蛋白胨 10.0 g、硫酸鉀 10.0 g、氯化鎂 1.4 g、溴化十六烷基三甲胺 0.2 g、瓊脂粉15 g，雙蒸水定容至1 L，pH調節(jié)至7.2，121℃滅菌20 min。

1.2?試驗方法

1.2.1?人參表面消毒及培養(yǎng)。

新鮮人參根莖經(jīng)由自來水沖洗后，用50%乙醇處理15 s，75%乙醇處理30 s。隨后，將人參于1% NaClO溶液中浸泡3 min，無菌水沖洗3～5次，收集沖洗廢液。將人參根莖剪成5 mm的小段置于固體假單胞菌基礎培養(yǎng)基中，于隔水式干燥培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)14 d左右。隨后，進行單菌落分選。

1.2.2?人參內生細菌總DNA提取和16s rDNA擴增。

將所分離的單菌落進行搖瓶培養(yǎng)，28 ℃，100 r/min培養(yǎng)3 d后，10 000 r/min離心1 min后，在菌體沉淀中加入200 μL緩沖液GA和20 μL蛋白酶K，振蕩;加入220 μL緩沖液GB，振蕩15 s后70℃水浴10 min;加入220 μL無水乙醇，振蕩15 s，轉至吸附柱中，隨后按說明書進行操作。使用紫外微量分光光度計檢測所提DNA的濃度和質量。

以所提DNA為模板，使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增。20 μL PCR擴增體系如下：2.0 μL 10×Taq Buffer（with Mg2+），1.5 μL 10 mmo/L dNTPs，0.5 μL 10 mmol/L 27F，0.5 μL 10 mmol/L 1492R，0.2 μL Taq酶，1.5 μL模板DNA，加無菌水補至20 μL。擴增條件為：95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán);72 ℃ 10 min。擴增所得PCR產物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。所回收的PCR產物送至生工生物工程（上海）有限公司進行測序。

1.2.3?次生代謝產物提取。收集上述假單胞菌培養(yǎng)液5 L，乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取物，經(jīng)旋轉蒸發(fā)和冷凍干燥，得到粗提物，稱重后，-20 ℃保存。

1.2.4?MDA-MB-231細胞培養(yǎng)及MTT活力檢測。

MDA-MB-231細胞貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2中培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞，接種于96孔板中，使每孔細胞數(shù)量為3×103個/100 μL。加入不同濃度粗提物（DMSO溶解），終濃度為0、0.5、2、8、32 μg/mL，每濃度設置3個平行孔。37 ℃、5% CO2下分別培養(yǎng)24、48 h后，棄上清，加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），37 ℃孵育4 h后，加入100 μL DMSO，使用酶標儀于570 nm處測定吸光度。

1.2.5?Western blot檢測Bcl-2、Bax等相關蛋白含量變化。

取處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞，接種于6孔板中，根據(jù)MTT比色結果，選擇32 μg/mL的粗提物進行刺激。刺激24 h后，提取總蛋白，經(jīng)BCA定量后，取20 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，后轉膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，

分別加入一抗（Bcl-2、Bax和GAPDH）4 ℃孵育過夜，加HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，ECL顯影。

2?結果與分析

2.1?人參內生假單胞菌G13476的分離與鑒定

人參表面經(jīng)無菌處理后，經(jīng)涂布分析顯示滅菌徹底。使用假單胞菌基礎培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，分離單菌落G13476。提取該菌的基因組DNA，進行PCR擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得一條大小約1 500 bp的特異性DNA片段，與細菌的16s rDNA長度一致（圖1）。此片段經(jīng)回收和測序，測序結果進行Blast分析，表明菌株G13476屬假單胞菌屬（圖2）。

2.2?菌株G13476抑制MDA-MB-231細胞生長

將菌株G13476進行發(fā)酵培養(yǎng)，收集發(fā)酵液，經(jīng)乙酸乙酯萃取，旋轉蒸發(fā)和冷凍干燥濃縮，獲得干粉，DMSO溶解，調整濃度至10 mg/mL。

由圖3可見，菌株G13476粗提取對MDA-MB-231細胞有明顯的抑制作用，隨著濃度的增加，抑制率增加，且隨著作用時間的延長，抑制率也隨之增加。在作用24 h，2 μg/mL粗提取的抑制率約為 35%，32 μg/mL粗提取的抑制率約為51%。試驗結果顯示，菌株G13476對乳腺癌細胞MDA-MB-231具有較好的抑制增殖作用。

2.3?菌株G13476調控Bcl-2和Bax蛋白含量

由圖4可知，菌株G13476粗提物可有效抑制Bcl-2蛋白含量，同時提升Bax的蛋白含量，且10 μg/mL的調控效果明顯優(yōu)于2 μg/mL。結果表明，菌株G13476可通過調控Bcl-2和Bax顯示抗腫瘤作用。

3?結論與討論

該研究以人參為對象，從中分離假單胞菌株G13476，并在乳腺癌細胞系MDA-MB-231中檢測其抗腫瘤效果。結果表明，假單胞菌株G13476具有較好的抗腫瘤活性，終濃度32 μg/mL的G13476粗提物的抑制率為51%。

人參被稱為“百草之王”，藥用價值廣泛，現(xiàn)代藥理研究顯示，人參具有抗腫瘤、抗炎癥、增加免疫力等作用。但因價格、蟲害等因素阻礙了人參的應用及推廣。近年來，隨著對內生菌研究的深入，人參內生菌中含有與人參功效相似的次生代謝產物，使其人參內生菌成為熱點研究領域之一。田磊等[10]從人參內生細菌中篩選到1株具有較為ACC脫氫酶活性的熒光假單胞桿菌;王卓等[11]發(fā)現(xiàn)2種人參內生真菌——GS-4和GS-22，其乙酸乙酯粗提物對人宮頸癌Hela細胞具有抑制作用，其半抑制濃度達60～140 μg/mL，這2種真菌分別屬于半裸鐮刀菌和半球菌。雖然有關人參內生菌的抗腫瘤活性和分離篩選研究較多，但有關內生假單胞菌的篩選和抗腫瘤活性研究較少。

乳腺癌是排位第一的女性常見惡性腫瘤，其發(fā)病率近年來出現(xiàn)升高且年輕化趨勢。三陰性乳腺癌是乳腺癌中較為特殊的一種類型，其雌激素受體、孕激素受體、HER-2受體均為陰性，因缺乏合適的治療靶點，導致其死亡率高于其他類型。因此，找尋乳腺癌（特別是三陰性乳腺癌）的新型治療藥物或手段成為研究熱點和重點[12-13]。相關文獻報道顯示，蒲公英提取物對三陰性乳腺癌細胞具有良好的抑制效果[14];中藥西黃丸可有效抑制三陰性乳腺癌細胞株Hs578T的增殖[15]。該研究以三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231為受測細胞，采用MTT比色法分析所分離的假單胞菌株G13476的抗腫瘤活性，結果表明，菌株G13476具有較好的抗三陰性乳腺癌活性。

B淋巴細胞瘤-2蛋白家族（B-cell lymphoma-2，Bcl-2），是較早開展研究的腫瘤相關蛋白。其中Bcl-2是一種原癌基因，位于t（14∶18）染色體異位斷裂處，其具有抗氧化、抑制凋亡等方面作用;Bax是一種促凋亡蛋白，其通過自身形成同源二聚體，進而破壞線粒體膜結構，進而激活caspase的級聯(lián)反應，誘導細胞死亡。因此，Bcl-2長久以來被認為是抗腫瘤藥物研究的熱點和重點[16-17]。傅思瑩等[18]研究發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯可有效降低侵潤性乳腺癌中Bcl-2蛋白表達，提高Bax蛋白含量。該研究結果顯示，人參內生假單胞桿菌G13476可通過下調Bcl-2蛋白含量、上調Bax蛋白含量，實現(xiàn)對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞的抑制。

綜上所述，該研究從人參中分離獲得一株具有抗腫瘤活性的菌株G13476，經(jīng)鑒定為假單胞桿菌屬，并在三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231中，發(fā)現(xiàn)其次生代謝產物可通過調控Bcl-2、Bax蛋白，實現(xiàn)抑制作用。該結果為人參內生菌在抗腫瘤藥物的開發(fā)和應用提供技術支撐和理論基礎。

參考文獻

[1] SIEGEL R L，MILLER K D，JEMAL A.Cancer statistics，2017[J].CA：A cancer journal for clinicians，2017，67（1）：7-30.

[2] 張繼博，史業(yè)輝，賈勇圣，等.三陰性乳腺癌治療進展[J].腫瘤，2017，37（7）：788-794.

[3] 徐家翠.人參化學成分的藥理活性及其含量積累的研究性進展[J].藥物與人，2015，28（1）：43.

[4] 占穎，劉春生，劉洋洋，等.人參和三七活性成分與藥理作用對比研究進展[J].中國中醫(yī)藥科技，2014，21（6）：711-712.

[5] MAO N，TAN R Z，WANG S Q，et al.Ginsenoside Rg1 inhibits angiotensin Ⅱ?induced podocyte autophagy via AMPK/mTOR/PI3K pathway[J].Cell biology international，2016，40（8）：917-925.

[6] LI Y，YANG T，LI J，et al.Inhibition of multiple myeloma cell proliferation by ginsenoside Rg3 via reduction in the secretion of IGF?1[J].Molecular medicine reports，2016，14（3）：2222-2230.

[7] OH Y，LIM H W，KIM K，et al.Ginsenoside Re improves skin barrier function in HaCaT keratinocytes under normal growth conditions[J].Bioscience biotechnology and biochemistry，2016，80（11）：2165-2167.

[8] WANG J，CHEN Y M，DAI C X，et al.Ginsenoside Rh2 alleviates tumor associated depression in a mouse model of colorectal carcinoma[J].American journal of translational research，2016，8（5）：2189-2195.

[9] WATERMAN C，CALCUL L，BEAU J，et al.miniaturized cultivation of microbiota for antimalarial drug discovery[J].Medicinal research reviews，2016，36（1）：144-168.

[10] 田磊，姜云，陳長卿，等.一株人參內生1-氨基環(huán)丙烷-1-1羧酸（ACC）脫氨酶活性細菌的篩選、鑒定及其對宿主生長的影響[J].微生物學報，2014，54（7）：760-769.

[11] 王卓，于慧美，劉鼎，等.人參內生真菌的分離及其抗腫瘤活性研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2013，15（9）：748-751.

[12] 潘曉曦，關一鳴，張舒娜，等.人參內生菌研究現(xiàn)狀與展望[J].人參研究，2014，26（3）：52-55.

[13] DIANA A，F(xiàn)RANZESE E，CENTONZE S，et al.Triple?negative breast cancers：Systematic review of the literature on molecular and clinical features with a focus on treatment with innovative drugs[J].Current oncology reports，2018，20（10）：76.

[14] LI X H，HE X R，ZHOU Y Y，et al.Taraxacum mongolicum，extract induced endoplasmic reticulum stress associated?apoptosis in triple?negative breast cancer cells[J].Journal of ethnopharmacology，2017，206：55-64.

[15] ZHENG W X，HAN S Y，JIANG S T，et al.Multiple effects of Xihuang pill aqueous extract on the Hs578T triple?negative breast cancer cell line[J].Biomed Rep，2016，5（5）：559-566.

[16] HUANG Z.Bcl?2 family proteins as targets for anticancer drug design[J].Oncogene，2000，19：6627-6631.

[17] MIRZAYANS R，ANDRAIS B，KUMAR P，et al.The growing complexity of cancer cell response to DNA?damaging agents：Caspase 3 mediates cell death or survival？[J].International journal of molecular sciences，2016，17（5）：708.

[18] 傅思瑩，何玉萍，王南卜，等.桃紅四物湯對浸潤性乳腺癌Bcl-2、Bax及Ki-67蛋白表達的影響[J].中醫(yī)藥學報，2018，46（4）：89-92.