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    便攜式食品直鏈和支鏈淀粉速測儀的研制

    2019-12-30 08:29:48馬家麟王虹蕾李玉林
    分析測試技術(shù)與儀器 2019年4期
    關(guān)鍵詞:支鏈直鏈青稞

    譚 亮,馬家麟,冀 恬,王虹蕾,王 婷,李玉林

    (1.中國科學(xué)院 西北高原生物研究所 公共技術(shù)服務(wù)中心,青海 西寧 810001;2.中國科學(xué)院 西北高原生物研究所 青海省青藏高原特色生物資源研究重點實驗室,青海 西寧 810001)

    紫外可見分光光度計是一種歷史悠久、覆蓋面廣、適用于多領(lǐng)域的分析儀器,在有機化學(xué)、生物化學(xué)、藥品分析、食品檢驗、醫(yī)藥工業(yè)、環(huán)境保護(hù)和生命科學(xué)等領(lǐng)域的科研、生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用[1-4]. 單波長雙光束分光光度計是經(jīng)單色器分光后經(jīng)反射鏡分解為強度相等的兩束光,一束通過參比池,一束通過樣品池. 光度計能自動比較兩束光的強度,此比值即為試樣的透射比,經(jīng)對數(shù)變換將它轉(zhuǎn)換成吸光度并作為波長的函數(shù)記錄下來. 其優(yōu)點是兩束光同時分別通過參比和樣品池,吸光度的大小不受入射光強度的影響,可以減少或消除因光源強度不穩(wěn)定而引入的誤差[5-8].

    實驗室目前使用的Varian Cary 300 Bio型單波長雙光束分光光度計存在的主要問題是使用空白溶液作參比,因此需要在樣品池中同時安裝參比和樣品池,增加了分光光度計的體積尺寸,不易于形成便攜式小型的體積構(gòu)造. 此外,根據(jù)雙波長比色原理,測定食品中的淀粉時,雖然可檢測得到直鏈淀粉、支鏈淀粉和總淀粉3組數(shù)據(jù),但每個樣品均需要分別測定4次兩種淀粉在檢測和參比波長處的吸光度(一個樣品需要切換波長反復(fù)比色4次),在進(jìn)行大批量樣品的檢測時,操作費時、效率低. 因此,我們開發(fā)研制了用于測定食品中直鏈和支鏈淀粉的便攜式速測儀. 測定時直接使用設(shè)定好的直鏈和支鏈淀粉各自的檢測和參比波長,只需測定兩次即可得到ΔA直和ΔA支. 檢測大批量樣品時,節(jié)省了操作時間,檢測效率得到很大的提高. 此外,無需用空白溶液作參比,沒有參比池,節(jié)省出多余的空間,其體積尺寸適于設(shè)計成小型的便攜式淀粉速測儀.

    1 工作原理

    依據(jù)等吸收雙波長消去比色法原理:吸收光譜重疊的a、b兩組分混合物中,若要消除b的干擾以測定a,可從b的吸收光譜上選擇兩個吸光度相等的波長λ1和λ2,測定混合物的吸光度差值,然后根據(jù)ΔA值來計算a的含量. 我們設(shè)計的便攜式淀粉速測儀將同一光源發(fā)出的光分成兩束,分別經(jīng)過兩個單色器后,得到兩束不同波長λ1和λ2的單色光. 利用切光器或斬波器將兩束光匯集成一條光路,并以一定的頻率交替照射同一吸收池引起脈沖信號,然后經(jīng)過光電倍增管和電子控制系統(tǒng)接收轉(zhuǎn)化為兩種波長的吸光度差ΔA,最后由顯示器顯示出來. 在同一吸收池中,樣品溶液本身就是自己的參比對照溶液,無需再用空白溶液作參比,只需測定兩次即可得到ΔA直和ΔA支,極大提高了大批量樣品的檢測效率. 因省去原有參比池,適于設(shè)計成小型的淀粉速測儀,便于攜帶并可現(xiàn)場快速檢測. 研制前后儀器的工作原理如圖1所示.

    圖1 實驗室單波長雙光束分光光度計(a)、研制的雙波長分光光度計(b)工作原理圖Fig. 1 Principle diagram of single wavelength and double beam spectrophotometers (a), development of dual-wavelength spectrophotometer (b)(1) 光源, (2) 光柵, (3、3*) 光閘, (4) 濾光片, (5) 斬波器, (6) 參比池, (7) 樣品池, (8) 光電倍增管

    2 儀器裝置各模塊及可實現(xiàn)功能

    便攜式食品直鏈和支鏈淀粉速測儀外觀如圖2所示. 整個儀器裝置主要包含4個模塊:(1)光路模塊:包括光源、濾色片、狹縫、光柵和樣品池,由主芯片STM32通過控制4臺步進(jìn)電機控制光路. 光源的光束經(jīng)過兩個單色器,經(jīng)過濾光片、入射狹縫、準(zhǔn)直鏡、光柵、物鏡和出射狹縫分為兩束單色光之后,通過斬波器和光閘將兩個單色器產(chǎn)生的不同波長的光線,匯集成一條光路,交替通過樣品池引起脈沖信號,并被光電倍增管交替接收轉(zhuǎn)化為兩種波長的吸光度差ΔA. (2)檢測模塊:光束通過樣品池后,經(jīng)過光電池、放大電路和A/D轉(zhuǎn)換器的轉(zhuǎn)換后變?yōu)殡娦盘柌⒎糯?,其結(jié)構(gòu)簡單,進(jìn)一步減小了儀器的體積,降低儀器成本. 將模擬電信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號之后輸給主芯片STM32,由它實現(xiàn)數(shù)據(jù)處理與分析,最后的分析結(jié)果通過液晶顯示屏輸出,實現(xiàn)人機交互. (3)硬件模塊:集檢測模塊、LCD液晶顯示屏、按鍵擴(kuò)展、RS232串口通信、打印機擴(kuò)展和電池缺電自動報警(電源監(jiān)控模塊)于一體[9]. 該儀器具有靈活的工作電源模式,具有電池、直流電源和交流220 V三種供電方式,適合不同場合使用. 儀器本身具有電池缺電自動報警功能,防止在電池缺電的情況下,檢測出不準(zhǔn)確的結(jié)果. 此外,點擊“保存”按鍵可以自動保存檢測結(jié)果,并可將檢測數(shù)據(jù)導(dǎo)入到電腦. 儀器可選配臺式微型打印機,點擊“打印”按鍵可實現(xiàn)快速自動打印檢測結(jié)果. (4)軟件模塊:系統(tǒng)的軟件采用C51語言編寫,通信部分的PC機軟件采用VC++6.0. 軟件模塊具有數(shù)據(jù)采集、處理、顯示、打印、通信和按鍵等. 其中,前期工作已經(jīng)采用雙波長比色法確定出食品直鏈和支鏈淀粉的測定和參比波長[10],并在該儀器的研制過程中直接將波長參數(shù)集成在儀器的MCS-51系列單片機系統(tǒng)中,試驗時無需再次進(jìn)行設(shè)定,只需通過點擊“選擇”按鍵,即可切換選擇直鏈和支鏈淀粉的測定,通過點擊“檢測”按鍵,即可自動在液晶顯示屏上顯示出直鏈淀粉在兩個波長下的吸光度值差值ΔA直和支鏈淀粉在兩個波長下的吸光度差值ΔA支,或者直鏈和支鏈淀粉在兩個波長下的透光率差值.

    圖2 便攜式食品直鏈和支鏈淀粉速測儀外觀圖Fig. 2 Appearance figure of portable speed measuring apparatus for amylose and amylopectin in food

    3 應(yīng)用實例

    3.1 直鏈和支鏈淀粉測定和參比波長的確定

    將質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的直鏈和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液加入碘試劑顯色后的,吸收曲線疊加于同一個坐標(biāo)系里(450~900 nm),如圖3所示. 依據(jù)溶液中某溶質(zhì)在兩個波長下均有吸收,則兩個波長的吸收差值與該溶質(zhì)濃度成正比的原理,通過等吸收雙波長消去法確定兩種淀粉各自的測定和參比波長. 當(dāng)測定直鏈淀粉含量時,選擇直鏈淀粉吸收峰波長λ2作為測定波長,在這一波長位置作x軸的垂線,此直線與干擾組分支鏈淀粉的吸收光譜相交于某一點(吸光度為A支2),再從該點作一條平行于x軸的直線,此直線又與支鏈淀粉的吸收光譜相交于等吸收點(吸光度為A支1,A支1=A支2),則選擇該交點相對應(yīng)的波長λ1作為直鏈淀粉的參比波長,從而消除在測定波長λ2處支鏈淀粉對直鏈淀粉含量測定的干擾. 同理,當(dāng)測定支鏈淀粉含量時,選擇支鏈淀粉吸收峰波長λ4作為測定波長,在這一波長位置作x軸的垂線,此直線與干擾組分直鏈淀粉的吸收光譜相交于某一點(吸光度為A直4),再從該點作一條平行于x軸的直線,此直線又與直鏈淀粉的吸收光譜相交于等吸收點(吸光度為A直3,A直3=A直4),則選擇該交點相對應(yīng)的波長λ3作為支鏈淀粉的參比波長,從而消除在測定波長λ4處直鏈淀粉對支鏈淀粉含量測定的干擾.

    由試驗結(jié)果可知:直鏈淀粉的測定和參比波長分別為λ2=563 nm和λ1=511 nm,支鏈淀粉的測定和參比波長分別為λ4=542 nm和λ3=722 nm.

    圖3 直鏈和支鏈淀粉吸收曲線疊加掃描圖(450~900 nm)Fig. 3 Superposition of scanning spectrum of absorption curve of amylose and amylopectin (450~900 nm)(1) 直鏈淀粉吸收曲線, (2) 支鏈淀粉吸收曲線

    3.2 方法學(xué)驗證

    3.2.1 線性關(guān)系考察

    直鏈淀粉雙波長標(biāo)準(zhǔn)曲線:準(zhǔn)確移取質(zhì)量濃度為0.990 1 mg/mL的直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL,分別置于6個25 mL容量瓶中,加入15 mL蒸餾水,并以濃度為1 mol/L的冰乙酸溶液調(diào)節(jié)pH為3.5,然后加入0.25 mL碘試劑,再加蒸餾水定容至25 mL,搖勻,靜置15 min后,以兩吸光度差值即ΔA直=Aλ2-Aλ1=A563 nm-A511 nm為縱坐標(biāo),直鏈淀粉質(zhì)量(m)為橫坐標(biāo),繪制直鏈淀粉雙波長標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖4所示. 由圖4可知,直鏈淀粉的質(zhì)量在0.198~0.594 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=0.309 9x-0.016 5,R2= 0.999 1.

    圖4 直鏈淀粉雙波長標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Dual-wavelength standard curve of amylase

    支鏈淀粉雙波長標(biāo)準(zhǔn)曲線:準(zhǔn)確移取質(zhì)量濃度為0.999 5 mg/mL的支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mL,分別置于6個25 mL容量瓶中,按照“3.2.1”所述步驟進(jìn)行,以兩吸光度差值即ΔA支=Aλ4-Aλ3=A542 nm-A722 nm為縱坐標(biāo),支鏈淀粉質(zhì)量(m)為橫坐標(biāo),繪制支鏈淀粉雙波長標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖5所示. 由圖5可知,支鏈淀粉的質(zhì)量在0.50~3.00 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y=0.136 6x- 0.019 9,R2=0.999 5.

    圖5 支鏈淀粉雙波長標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 5 Dual-wavelength standard curve of amylopectin

    3.2.2 精密度

    準(zhǔn)確移取一份已制備好的淀粉提取液(采自青海玉樹的四長二短芒白青稞)1.0 mL置于25 mL容量瓶中,按照“3.2.1”所述步驟進(jìn)行,于511、542、563、722 nm 4個波長處重復(fù)測定吸光度A511 nm、A542 nm、A563 nm、A722 nm共6次,計算直鏈和支鏈淀粉含量的RSD值,確定檢測精密度. 測定結(jié)果:青稞淀粉提取液中直鏈和支鏈淀粉含量的RSD分別為0.62%和0.45%,表明檢測精密度良好.

    3.2.3 穩(wěn)定性

    準(zhǔn)確移取一份已制備好的淀粉提取液(采自青海玉樹的四長二短芒白青稞)1.0 mL置于25 mL容量瓶中,按照“3.2.1” 項下所述步驟進(jìn)行,室溫下放置,于511、542、563、722 nm 4個波長處每隔1 h測定吸光度A511 nm、A542 nm、A563 nm、A722 nm各一次,計算直鏈和支鏈淀粉含量的RSD值,確定檢測溶液的穩(wěn)定性. 結(jié)果表明青稞淀粉測定液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好,直鏈和支鏈淀粉含量的RSD分別為1.1%和1.3%.

    3.2.4 重復(fù)性

    準(zhǔn)確移取5份已制備好的同一淀粉提取液(采自青海玉樹的四長二短芒白青稞)各1.0 mL置于5個25 mL容量瓶中,按照“3.2.1” 所述步驟進(jìn)行,于511、542、563、722 nm 4個波長處測定吸光度A511 nm、A542 nm、A563 nm、A722 nm,計算直鏈和支鏈淀粉含量的RSD值,確定檢測重復(fù)性. 結(jié)果青稞淀粉提取液中直鏈和支鏈淀粉含量的RSD分別為1.5%和1.8%,結(jié)果表明檢測重復(fù)性良好.

    3.2.5 回收率

    采用加樣回收法,稱取已粉碎過250 μm孔徑篩并且已知直鏈和支鏈淀粉含量的青稞樣品(采自青海玉樹的四長二短芒白青稞)粉末9份,每份50 mg(準(zhǔn)確至±1 mg),分別按低、中、高濃度精密加入直鏈淀粉(0.990 1 mg/mL)和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液(5.005 mg/mL)2.5、5.0、7.5 mL,每一濃度3份,按照“3.2.1” 所述步驟進(jìn)行,于511、542、563、722 nm 4個波長處測定吸光度A511 nm、A542 nm、A563 nm、A722 nm,計算直鏈和支鏈淀粉含量的平均回收率和RSD值,確定檢測的回收率. 結(jié)果如表1、2所列. 由表1、2可見,直鏈和支鏈淀粉含量的平均回收率分別為91.14%和91.73%,RSD分別為1.70%和2.25%,表明檢測具有良好的準(zhǔn)確性.

    表1 直鏈淀粉回收率試驗結(jié)果(n = 9)Table 1 Results of recovery test of amylose (n = 9)

    表2 支鏈淀粉回收率試驗結(jié)果(n = 9)Table 2 Results of recovery test of amylopectin (n = 9)

    3.2.6 定量限和檢出限

    依據(jù)ICH指導(dǎo)原則中Q2(R1)分析方法的驗證方法學(xué)內(nèi)容,根據(jù)一定量空白響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(σ)和被測物標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(S)來計算定量限(QL=10×σ/S)和檢出限(DL=3.3×σ/S). 通過繪制直鏈和支鏈淀粉雙波長標(biāo)準(zhǔn)曲線以確定斜率S,另準(zhǔn)確移取10份1.0 mL不加樣品的提取液作為空白對照溶液,于511、542、563、722 nm 4個波長處測定吸光度A511 nm、A542 nm、A563 nm、A722 nm,求出這10份空白對照溶液響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差σ,結(jié)果如表3、4所列.

    表3 直鏈淀粉定量限和檢出限試驗結(jié)果(n = 10)Table 3 Results of quantitative limit and detection limit test of amylose (n = 10)

    表4 支鏈淀粉定量限和檢出限試驗結(jié)果(n = 10)Table 4 Results of quantitative limit and detection limit test of amylopectin (n = 10)

    3.3 青稞中直鏈和支鏈淀粉的含量測定

    將粉碎過250 μm孔徑篩的青稞粉末100 mg置于25 mL容量瓶中,加入0.5 mL無水乙醇,渦旋以潤濕樣品. 加入1.0 mL質(zhì)量濃度為1.0 mol/L的氫氧化鈉溶液,渦旋混勻后置沸水浴中加熱2 min,再取出渦旋30 s,如此重復(fù)3~5次后冷卻至室溫,定容至25 mL,搖勻,過濾,制得淀粉提取液. 準(zhǔn)確移取淀粉提取液1.0 mL置于另一25 mL容量瓶中,分別加入15 mL蒸餾水,并以濃度為1 mol/L的冰乙酸溶液調(diào)節(jié)pH為3.5,然后加入0.25 mL碘試劑,再加蒸餾水定容,搖勻,制得淀粉測定液. 靜置15 min后,分別測定兩吸光度差值即ΔA直和ΔA支,并分別在直粉、支鏈淀粉雙波長標(biāo)準(zhǔn)曲線上,查得兩種淀粉測定液各自的兩吸光度差值所對應(yīng)的淀粉質(zhì)量,分別計算出青稞中直鏈和支鏈淀粉的含量,二者之和為青稞總淀粉含量,結(jié)果如表5所列. 直鏈和支鏈淀粉及總淀粉的含量(以干基計,按GB/T 20264、GB/T 21305測定水分)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω,分別按式⑴、式⑵、式⑶進(jìn)行計算:

    (1)

    (2)

    ω=ω1+ω2

    (3)

    式中:ω1—青稞中直鏈淀粉(以干基計)的含量,單位為克每百克(g/100g);ω2—青稞中支鏈淀粉(以干基計)的含量,單位為克每百克(g/100g);ω—青稞中總淀粉(以干基計)的含量,單位為克每百克(g/100g);m1—從雙波長直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得供試品溶液中直鏈淀粉質(zhì)量,單位為毫克(mg);m2—從雙波長支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得供試品溶液中支鏈淀粉質(zhì)量,單位為毫克(mg);V1、V2—移取制備直鏈和支鏈供試品溶液體積,單位為毫升(mL);V—樣品顯色定容總體積,單位為毫升(mL);m—試樣的質(zhì)量,單位為毫克(mg);wm—試樣的含水量,%.

    每個樣品取兩個平行樣進(jìn)行測定,以其算術(shù)平均值作為測定結(jié)果,保留小數(shù)點后1位. 在重復(fù)條件下兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的5%.

    由表5可見,青海境內(nèi)青稞中支鏈淀粉含量均高于直鏈淀粉含量,約高出5.4倍. 來自青海稱多的湟源藍(lán)青稞總淀粉含量最高為75.4 g/100g DW,來自青海玉樹的長芒白青稞總淀粉含量最低為64.0 g/100g DW.

    表5 青海境內(nèi)不同產(chǎn)地和品種青稞中直鏈和支鏈淀粉的含量結(jié)果(n = 3)Table 5 Determination results of amylose and amylopectin in hullessbarley samples collected from different habitats and varieties in Qinghai (n = 3) /(g/100 g DW)

    3.4 不同設(shè)備檢測比對驗證

    中國科學(xué)院西北高原生物研究所分析測試中心實驗室抽檢了一種青稞樣品(來自青海玉樹的長芒白青稞,由青海大學(xué)農(nóng)牧科學(xué)院送檢). 分別使用研制的便攜式食品直鏈和支鏈淀粉速測儀和目前分析測試中心實驗室使用的Varian Cary 300 Bio型單波長雙光束分光光度計測定此樣品中直鏈和支鏈淀粉的含量,以進(jìn)行不同設(shè)備檢測之間的比對驗證試驗,每臺設(shè)備均測定6次,以確定檢測結(jié)果的重現(xiàn)性,結(jié)果如表6所列. 由表6可見,不同設(shè)備檢測結(jié)果的RSD在0.58%~1.79%之間,不同設(shè)備之間檢測直鏈和支鏈淀粉的RSD分別為3.30%、2.21%,結(jié)果表明使用所研制設(shè)備的檢測系統(tǒng)適用性良好.

    表6 使用不同設(shè)備測定的青稞中直鏈和支鏈淀粉含量(n = 3)Table 6 Determination results of amylose and amylopectin in hullessbarley samples using different equipments (n = 3) /(g/100 g DW)

    3.5 實驗室間比對驗證

    中國科學(xué)院西北高原生物研究所分析測試中心實驗室抽檢了二種青稞樣品(分別來自青海湟源的湟源花青稞和青海玉樹的長芒白青稞,由青海大學(xué)農(nóng)牧科學(xué)院送檢),統(tǒng)一制備,進(jìn)行這二種青稞樣品中直鏈和支鏈淀粉的含量測定,同時發(fā)送至中國科學(xué)院西北高原生物研究所生態(tài)中心實驗室和青海省水文地質(zhì)工程地質(zhì)環(huán)境地質(zhì)調(diào)查院檢測實驗室進(jìn)行實驗室間比對驗證試驗,每個實驗室均測定6次,以確定研制的便攜式食品淀粉速測儀與其他實驗室設(shè)備檢測的重現(xiàn)性,結(jié)果如表7~9所列. 由表7~9可見,實驗室內(nèi)檢測結(jié)果的RSD均低于2.5%,不同實驗室間(均與中國科學(xué)院西北高原生物研究所分析測試中心實驗室比較)檢測結(jié)果的RSD均低于4.2%,結(jié)果表明使用所研制設(shè)備的檢測系統(tǒng)適用性良好,檢測具有良好的重現(xiàn)性.

    表7 分析測試中心實驗室測定的二種不同青稞中直鏈和支鏈淀粉含量(n = 3)Table 7 Determination results of amylose and amylopectin in two different hullessbarley samples by Laboratory of Analytical Testing Center (n = 3) /(g/100 g DW)

    表8 1#實驗室測定的二種青稞中直鏈和支鏈淀粉含量(n = 3)Table 8 Determination results of amylose and amylopectin in two different hullessbarley samples by Lab #1 (n = 3) /(g/100 g DW)

    表9 2#實驗室測定的二種青稞中直鏈和支鏈淀粉含量(n = 3)Table9 Determination results of amylose and amylopectin in two different hullessbarley samples by Lab #2 (n = 3) /(g/100g DW)

    4 結(jié)論

    研制的便攜式食品直鏈和支鏈淀粉速測儀是一款小型、便于攜帶的雙波長分光光度計. 依據(jù)等吸收雙波長消去法原理,確定直鏈淀粉的測定和參比波長分別為563 nm和511 nm,支鏈淀粉的測定和參比波長分別為542 nm和722 nm. 驗證試驗結(jié)果表明:使用研制的便攜式食品直鏈和支鏈淀粉速測儀進(jìn)行兩種淀粉含量檢測,其線性關(guān)系良好,檢測過程簡單、快速、準(zhǔn)確,測定時只在同一吸收池中比色,樣品溶液本身又是自己的參比對照溶液,無需再用空白溶液作參比,只需測定二次即可得到ΔA直和ΔA支,提高了樣品的檢測效率,為方便、快速、準(zhǔn)確地檢測大批量樣品中兩種淀粉提供了技術(shù)支撐,具有很強的應(yīng)用推廣價值.

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