調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯及植株中的殘留和消解分析

董見(jiàn)南，李雪茹，陳國(guó)峰，劉 峰，張曉波，廖 輝

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

調(diào)環(huán)酸鈣（Prohexadione-calcium）化學(xué)名稱為3,5-二氧代-4-丙?；h(huán)己烷羧酸鈣，是由日本組合化學(xué)工業(yè)公司（Kumiai Chemical Industry Co.,Ltd.）合成開(kāi)發(fā)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。其常見(jiàn)用于禾谷科作物，能有效地抑制作物節(jié)端生長(zhǎng)，縮短莖稈長(zhǎng)度，使莖稈粗壯、植株矮化抗倒伏[1,2]，也有報(bào)道用于花生[3]和煙草[4]，目前馬鈴薯也開(kāi)始開(kāi)發(fā)使用調(diào)環(huán)酸鈣用作植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。關(guān)于調(diào)環(huán)酸鈣的研究主要集中在合成[5,6]、制劑研制[7]、制劑含量分析[8,9]及生產(chǎn)應(yīng)用研究[1,4]，殘留分析方面的報(bào)道主要集中在糙米中分析方法研究及檢測(cè)結(jié)果[10]方面。雖然調(diào)環(huán)酸鈣屬低毒低殘留農(nóng)藥[1]，但其原藥有胎鼠致畸毒性的報(bào)道[11]，因此調(diào)環(huán)酸鈣在農(nóng)作物中的殘留量應(yīng)引起人們的重視。本文建立了馬鈴薯及馬鈴薯植株中調(diào)環(huán)酸鈣的分析方法，并應(yīng)用于田間樣品的分析，為指導(dǎo)農(nóng)藥的合理安全使用及制定中國(guó)調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯上的最大殘留限量提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試 劑

調(diào)環(huán)酸鈣（92.0%）標(biāo)準(zhǔn)品由Dr. Ehrenstorfer GmbH公司提供，乙腈（色譜純，迪馬公司），甲醇（色譜純，迪馬公司），甲酸（色譜純，迪馬公司），無(wú)水Na2SO4（分析純，北京化學(xué)試劑公司），N-丙基乙二胺（Primary secondary amine，PSA，40-60 μm，博納艾杰爾公司），弗羅里硅土（40-60目，博納艾杰爾公司）。

1.2 儀器設(shè)備

ACQUITY UPLC/TQ Detector 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters 公司）；Shim-pack GISS C18（50 mm×2.1 mm，1.9 μm）色譜柱（日本島津公司）；BSA6202S 電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）；HS501 振蕩器，MS3 basic 渦旋混合器（德國(guó)IKA 公司）；N-EVAP 112 氮吹儀（美國(guó)Organomation Associates公司）；過(guò)濾器（濾膜孔徑0.22 μm）；常用玻璃器皿。

1.3 田間試驗(yàn)

供試藥劑為8%調(diào)環(huán)酸鈣泡騰顆粒劑，推薦劑量為24～48 g/hm2（制劑用藥量300～600 g/hm2）。參照農(nóng)業(yè)部《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[12]，2017年在黑龍江省哈爾濱市和湖南省長(zhǎng)沙市2地進(jìn)行了消解動(dòng)態(tài)和最終殘留試驗(yàn)。黑龍江試驗(yàn)地的馬鈴薯品種為‘尤金’，湖南試驗(yàn)地的馬鈴薯品種為‘費(fèi)烏瑞它’。

消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)：施藥劑量為72 g/hm2（制劑用藥量900 g/hm2）。施藥后2 h，1，2，3，5，7，10，14，21，30和45 d采集馬鈴薯植株樣品。最終殘留試驗(yàn)：設(shè)2 個(gè)施藥劑量，低劑量施藥量為48 g/hm2（制劑用藥量600 g/hm2），高劑量施藥量為72 g/hm2（制劑用藥量900 g/hm2），每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)小區(qū)，每小區(qū)30 m2，馬鈴薯收獲期采集馬鈴薯塊莖。施藥時(shí)期均為馬鈴薯現(xiàn)蕾期。另設(shè)不施藥的馬鈴薯田為對(duì)照區(qū)，于施藥前采集馬鈴薯植株空白對(duì)照樣品，于馬鈴薯收獲期采集馬鈴薯空白對(duì)照樣品。樣品采集后用自封袋密封，貼好標(biāo)簽后-20 ℃以下保存。

1.4 分析方法

1.4.1 前處理

參考調(diào)環(huán)酸鈣的溶解度、解離常數(shù)及韋婕等[10]的研究結(jié)果，經(jīng)優(yōu)化后確立馬鈴薯及馬鈴薯植株的前處理方法。準(zhǔn)確稱取馬鈴薯、馬鈴薯植株樣品10.0 g，加入20 mL酸化乙腈（體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸），加蓋后振蕩提取30 min，加入10 g無(wú)水Na2SO4，渦旋1 min鹽析，然后以3 500 r/min離心5 min。

移取2 mL上清液至玻璃試管中，40 ℃水浴下N2吹干。用超純水定容至1 mL，過(guò)0.22 μm 水系濾膜，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法進(jìn)行定性和定量分析。

1.4.2 儀器條件

色譜柱：Shim-pack GISS C18（50 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱溫35 ℃；流速0.25 mL/min；梯度洗脫（流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為乙腈）：0～1.0 min 為90%A，1.5 min 為50%A，3.0 min 為50%A，3.2 min為90%A。進(jìn)樣量10 μL。電噴霧離子源ESI；正離子源模式；毛細(xì)管電壓為3.0 kV；錐孔電壓為25 V；離子源溫度為120 ℃；干燥器溫度為350 ℃；干燥器流速650 L/h；錐孔氣流量50 L/h；調(diào)環(huán)酸鈣在流動(dòng)相中電離為調(diào)環(huán)酸，質(zhì)譜監(jiān)測(cè)對(duì)象為調(diào)環(huán)酸，多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式，調(diào)環(huán)酸以離子對(duì)（m/z）214.2→158.1 進(jìn)行定量分析，214.2→141.0 進(jìn)行定性分析。在上述色譜條件下，調(diào)環(huán)酸的保留時(shí)間為2.2 min。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

稱取調(diào)環(huán)酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品0.010 9 g（精確至0.000 1 g），用少量pH 2的磷酸水溶液溶解，再用超純水定容至刻度線，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，試驗(yàn)時(shí)再用超純水逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為2.0，1.0，0.5，0.1，0.05 和0.01 mg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在選定的儀器條件下測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x）、定量離子峰峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.4.4 方法的回收率和精密度

向空白馬鈴薯及馬鈴薯植株中添加調(diào)環(huán)酸鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得馬鈴薯樣品中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02，0.05，0.5 mg/kg，馬鈴薯植株樣品中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05，0.5，2.0 mg/kg。每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，按照1.4.3方法測(cè)定，以添加回收樣品峰面積和相應(yīng)進(jìn)樣濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積相比較，計(jì)算回收率；以各質(zhì)量分?jǐn)?shù)的5次重復(fù)試驗(yàn)的回收率計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化

嘗試了超高效液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法。調(diào)環(huán)酸鈣在流動(dòng)相中電離為調(diào)環(huán)酸，質(zhì)譜監(jiān)測(cè)對(duì)象為調(diào)環(huán)酸，用電噴霧離子源分別采用正/負(fù)模式下進(jìn)行全掃描（m/z 50～350），可得到3 個(gè)調(diào)環(huán)酸準(zhǔn)分子離子峰：[M-1]峰（m/z 211.3）、[M+1]峰（m/z 213.1）和[M+2]峰（m/z 214.2），比較儀器響應(yīng)值可得正離子模式響應(yīng)遠(yuǎn)高于負(fù)離子模式，選用調(diào)環(huán)酸[M+2]峰（m/z 214.2）為母離子。通過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)，分別選擇離子對(duì)（m/z）214.2→158.1 進(jìn)行定量分析，選擇離子對(duì)（m/z）214.2→141.0進(jìn)行定性分析，見(jiàn)圖1。

2.2 前處理方法摸索

比較了乙腈、0.2%甲酸乙腈、甲醇和0.2%甲酸甲醇4 種提取溶劑的提取效率，結(jié)果見(jiàn)圖2。酸化乙腈和酸化甲醇的提取效率明顯高于乙腈和甲醇，且提取率更穩(wěn)定，這可能與調(diào)環(huán)酸鈣易酸解離有關(guān)。由于乙腈易與水相分離，既去除了水溶性雜質(zhì)且利于后續(xù)的濃縮步驟，因此本文最終選擇使用0.2%甲酸乙腈作提取溶劑。對(duì)濃縮后的提取液，通過(guò)比較無(wú)凈化、25 mg PSA 和50 mg 弗羅里硅土的試驗(yàn)結(jié)果可知，PSA 對(duì)調(diào)環(huán)酸鈣有明顯的吸附作用，弗羅里硅土的凈化效果不顯著。由于濃縮后的定容液為超純水，即可去除酸化乙腈提取液中的部分弱極性雜質(zhì)，因此最終選擇超純水定容且不需要其他凈化步驟。

圖1 調(diào)環(huán)酸鈣的二級(jí)質(zhì)譜圖Figure 1 Typical daughter scan chromatograms of prohexadione-calcium

圖2 4種不同提取溶劑對(duì)馬鈴薯及馬鈴薯植株中調(diào)環(huán)酸鈣的提取效率Figure 2 Extraction efficiencies of four different solvents on extraction of prohexadione-calcium from potato and potato plant

2.3 檢測(cè)方法評(píng)價(jià)

用超純水配制不同質(zhì)量濃度的調(diào)環(huán)酸鈣系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度與儀器條件見(jiàn)1.4.2，在0.01～2.0 mg/L濃度線性良好，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線為：y = 10 280 x +137.3，R2為0.999 6。

調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯及馬鈴薯植株中的添加回收試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，典型色譜圖如圖3所示。在馬鈴薯中的平均回收率為87.8%～99.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.7%～3.2%；在馬鈴薯植株中的平均回收率為93.9%～98.0%，RSD 為2.1%～4.8%。將最小添加濃度確定為方法的定量限（LOQ，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，mg/kg），調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯及馬鈴薯植株中的LOQ 分別為0.02 和0.05 mg/kg。中國(guó)制定的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)（GB 2763-2016）中尚無(wú)調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯中的最大殘留限量（MRL），韓國(guó)已制定調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯中的MRL值為0.2 mg/kg。結(jié)果表明所建方法的準(zhǔn)確度、精密度及靈敏度較好，均符合農(nóng)藥殘留分析試驗(yàn)的要求。

表1 調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯及馬鈴薯植株中的添加回收率Table 1 Recoveries of prohexadione-calcium in potato and potato plant

圖3 調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯及馬鈴薯植株空白和基質(zhì)匹配標(biāo)樣的典型色譜圖Figure 3 Typical UPLC-MS/MS chromatograms of prohexadione-calcium in potato and potato plant

2.4 調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯植株中的消解動(dòng)態(tài)

由圖4結(jié)果所示，調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯植株中的殘留量隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，其消解過(guò)程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，經(jīng)擬合后計(jì)算可知，調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯植株中的消解半衰期分別為1.4 d（黑龍江）和1.5 d（湖南），原始沉積量在0.37～0.56 mg/kg。由半衰期可知，不同試驗(yàn)地域的氣候類型和作物品種等差異對(duì)調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯植株體內(nèi)的消解速率影響不大，且消解迅速。

圖4 調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯植株中的消解趨勢(shì)Figure 4 Residue dissipation curves of prohexadione-calcium in potato plant

表2 調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯最終殘留樣品中的殘留量Table 2 Final residues of prohexadione-calcium in potato

2.5 調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯中的最終殘留

按照有效成分48 和72 g/hm2的劑量在馬鈴薯現(xiàn)蕾期施用1 次，馬鈴薯收獲時(shí)采集馬鈴薯塊莖樣本進(jìn)行殘留量測(cè)定。結(jié)果表明馬鈴薯中調(diào)環(huán)酸鈣的最終殘留量均＜0.02 mg/kg（表2）。韓國(guó)制定調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯中的最大殘留限量（MRL）值為0.2 mg/kg，試驗(yàn)結(jié)果表明按照此施藥方法施用，收獲馬鈴薯中調(diào)環(huán)酸鈣的殘留量在0.2 mg/kg 以下。以上數(shù)據(jù)為中國(guó)制定調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯上的MRL值提供了數(shù)據(jù)支持。

3 討 論

由于調(diào)環(huán)酸鈣的辛醇-水分配系數(shù)（KowlogP）為-2.9，解離常數(shù)（pKa）為5.15，其在水及有機(jī)溶劑中的溶解能力和酸解離現(xiàn)象使得目標(biāo)基質(zhì)中調(diào)環(huán)酸鈣的提取和濃縮成為其殘留檢測(cè)分析的難點(diǎn)。目前尚無(wú)調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯中提取方法的報(bào)道，本研究結(jié)合調(diào)環(huán)酸鈣的理化特性和稻米[10]中調(diào)環(huán)酸鈣檢測(cè)方法，比較了4種不同溶劑的提取效率，結(jié)果表明酸化甲醇和酸化乙腈提取效率優(yōu)于甲醇和乙腈且更穩(wěn)定。由于酸化乙腈對(duì)馬鈴薯基質(zhì)的提取效果更佳，且乙腈更易于與水分離，本文最終選擇酸化乙腈作為提取溶劑，這與韋婕等[10]在稻米中的研究結(jié)果相一致。分析原因可能為適當(dāng)?shù)腍+濃度能抑制調(diào)環(huán)酸鈣的電離，使其更容易以分子形式存在，從而更容易進(jìn)入有機(jī)溶劑中易于提取。乙腈與水的混溶和鹽析特性在保證提取效率的同時(shí)簡(jiǎn)化了凈化步驟，本研究用無(wú)水Na2SO4代替經(jīng)典QuERChERS[13]方法中的NaCl，提供鹽離子的同時(shí)吸收乙腈中的微量水分，更利于后續(xù)的濃縮操作。本研究嘗試了分散固相萃取的凈化方法，對(duì)濃縮后的提取液進(jìn)行了無(wú)凈化、25 mg PSA和50 mg弗羅里硅土3種試驗(yàn)。結(jié)果表明PSA對(duì)調(diào)環(huán)酸鈣有強(qiáng)吸附作用，使用后回收率大大降低；弗羅里硅土無(wú)明顯凈化效果，使用后進(jìn)樣溶液顏色無(wú)目視變化且靈敏度無(wú)明顯提高。本試驗(yàn)濃縮后使用超純水定容，該換相處理有效地去除了易溶于乙腈且不易溶于水相的弱極性雜質(zhì)，從而達(dá)到了凈化目的。韋婕等[10]在進(jìn)行稻米中調(diào)環(huán)酸鈣的檢測(cè)時(shí)同樣將提取液濃縮后直接用超純水定容。結(jié)果表明凈化劑PSA和弗羅里硅土不適用于調(diào)環(huán)酸鈣的提取，換相定容的試驗(yàn)方法能有效去除雜質(zhì)。本文將超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜用于調(diào)環(huán)酸鈣的檢測(cè)，結(jié)果表明超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜能穩(wěn)定的檢測(cè)調(diào)環(huán)酸鈣并表現(xiàn)出較高的靈敏度，相比于已報(bào)道的紫外檢測(cè)器[8-10]的檢測(cè)手段，串聯(lián)質(zhì)譜擁有更強(qiáng)的抗干擾能力，為前處理過(guò)程中的濃縮和凈化步驟減少了壓力。然而串聯(lián)質(zhì)譜靈敏度的穩(wěn)定性一直是此項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)的難點(diǎn)，且其線性范圍較窄，這些都是科研工作者今后研究探索的重點(diǎn)。同時(shí)開(kāi)發(fā)和發(fā)現(xiàn)適合調(diào)環(huán)酸鈣類似結(jié)構(gòu)和理化特性的凈化劑，或固相萃取方法，在分離調(diào)環(huán)酸鈣和雜質(zhì)、提高檢測(cè)分析的靈敏度方面或可有更大益處。本研究建立了采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)馬鈴薯和馬鈴薯植株中調(diào)環(huán)酸鈣殘留量的方法，該方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性和靈敏度均能滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求。

消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)結(jié)果表明，調(diào)環(huán)酸鈣在黑龍江和湖南2試驗(yàn)地馬鈴薯植株中的消解半衰期分別為1.4和1.5 d，試驗(yàn)地氣候類型和作物品種等差異對(duì)調(diào)環(huán)酸鈣在植株中的原始沉積量和消解速率影響不大，調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯植株體內(nèi)消解迅速。

最終殘留試驗(yàn)結(jié)果表明，以最高推薦施藥劑量48 g/hm2和1.5倍最高推薦施藥劑量72 g/hm2在馬鈴薯現(xiàn)蕾期施用一次，收獲期馬鈴薯中的調(diào)環(huán)酸鈣殘留量均＜0.02 mg/kg。中國(guó)未制定調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯中的最大殘留限量，韓國(guó)規(guī)定為0.2 mg/kg，結(jié)果表明，按照推薦劑量施用調(diào)環(huán)酸鈣制劑后，收獲馬鈴薯中調(diào)環(huán)酸鈣的殘留量是安全的（相對(duì)韓國(guó)的限量標(biāo)準(zhǔn)），此試驗(yàn)數(shù)據(jù)為中國(guó)制定調(diào)環(huán)酸鈣在馬鈴薯上的MRL值提供了數(shù)據(jù)支持。