豬藍耳病抗體高敏熒光免疫層析快檢試劑盒的研制

王澤洲，張毅，吳俊清，章健，陳弟詩，賀冬梅

（1.四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041；2.成都微瑞生物科技有限公司，四川 成都 611731）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）簡稱豬藍耳病，是我國養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一［1］。PCR、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、膠體金技術等在PRRS的診斷、流行病學調查和監(jiān)測等方面發(fā)揮了重要作用［2-5］，但在即時現場快速檢測方面存在不足。本研究應用鑭系元素銪（Eu）作熒光標記物研制了一種既簡單、快捷，又準確、特異、敏感的豬藍耳病抗體高敏熒光免疫層析快速檢測試劑盒（PRRS-LFICA）?，F將研究結果報告如下：

1 材料與方法

1.1 材料 PRRS表達蛋白抗原、兔抗雞IgY抗體、雞IgY抗體，鑭系熒光納米微球和Wellray?WR-1608熒光儀；吸水紙、樣品墊、硝酸纖維素膜，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），N-羥基琥珀酰亞胺，切條機、點膜與噴金膜機，其他試劑均為國產分析純。還需準備豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）等7種病毒的陽性血清IDEXX試劑盒。

此外，制備包被膜、抗原標記微球、夾心法建立等，均參照說明書或按相關要求操作。

1.2 熒光免疫層析試紙條的組裝 在濕度小于30%，溫度20～25 ℃的環(huán)境下，把吸水紙、標記物墊和樣品墊按順序粘貼在聚氯乙烯底板上形成微反應體系，然后將其切割成0.5 cm寬，即成試紙條，將試紙條裝入卡殼中制成檢測卡，裝入鋁箔袋封存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 特異性試驗 以建立的判斷標準（標準曲線）與CSFV、PCV-2、PRV、PPV、JEV、PEDV、TGEV陽性血清進行豬藍耳病抗體鑭系熒光免疫層析檢測，同時設陽性、陰性對照，旨在確定該檢測方法是否發(fā)生交叉反應。

1.4 敏感性試驗 將PRRSV標準陽性血清進行1∶4、1∶16、1∶64、1∶256、1∶1 024、1∶4 096、1∶16 384倍比稀釋，每個稀釋度平行做4個重復，用組裝的PRRS-LFICA試劑盒檢測，將結果換算成S∕P值，判斷抗體檢出效價。

1.5 重復性試驗

1.5.1 批內重復性試驗 在相同條件下，選取12份PRRSV抗體水平不同的血清樣本，每份樣本平行做8個重復，用組裝的PRRS-LFICA試劑盒（批號：20170831）檢測，對檢測結果進行統(tǒng)計學分析。

1.5.2 批間重復性試驗 在相同條件下，選取12份PRRSV抗體水平不同的血清樣本，分別用4批PRRS-LFICA試劑盒檢測（批號分別為20170831、20171107、20171221、20180117），然后對檢測結果進行統(tǒng)計學分析。

1.6 比較試驗 分別用組裝的PRRS-LFICA試劑盒和ELISA試劑盒（IDEXX）檢測臨床樣品200份，比較兩種方法的符合率。

1.7 試劑盒的組裝及保存期試驗 PRRS-LFICA試劑盒由熒光檢測儀、檢測卡、連接線組成。試劑盒置4 ℃保存，于保存后60、120、180、240、300、360、420、480 d按照PRRS-LFICA各個優(yōu)化條件，對PRRSV陽性和陰性參考血清進行檢測，然后對結果進行統(tǒng)計學分析。

1.8 現場應用試驗 用研制的PRRS-LFICA試劑盒對來自四川省內的2 336份送檢樣本進行檢測，了解PRRSV血清抗體陽性率。

2 結果

2.1 測定條件的選擇

2.1.1 標記量的選擇 把標記好的質量比（抗體∕微球）不同的熒光微球稀釋相同倍數，組裝成檢測卡，在檢測卡加樣孔分別加入80 μL參考樣本，室溫下層析15 min，檢測，考察并驗證不同標記量對標記結果的影響。結果表明，隨標記抗原濃度的增加，各濃度點的結合率呈現先增后降的趨勢，在抗原∕微球的質量比為1∶25時有最大值。因此，選擇標記比例為1∶25的免疫微球進行后續(xù)實驗。

2.1.2 加樣量的選擇 在其他條件一致的情況下，考察并驗證樣本不同稀釋倍數對檢測結果的影響。在檢測卡加樣孔里分別加入稀釋10、20、30、40、50、60、70倍的參考樣本，室溫下反應15 min后檢測。結果表明，隨稀釋倍數的增加，各濃度點的結合率均減小。當樣本稀釋倍數為40倍時，繼續(xù)降低稀釋倍數，結合率增加不明顯，免疫反應基本飽和。因此，后續(xù)實驗選擇樣本稀釋倍數40倍為加樣量。

2.1.3 檢測時間的選擇 在檢測卡加樣孔中加入80 μL參考樣本，室溫下免疫反應，分別在5、10、15、20、25、30 min時檢測，考察不同檢測時間對結果的影響。結果表明，隨著檢測時間的延長，各濃度點的結合率基本呈現增加的趨勢，試紙靜置15 min檢測即能達到較高的結合率，而隨著檢測時間的增加，各濃度點的結合率不再發(fā)生較大的變化，趨于平穩(wěn)，說明在15 min時試紙條上的雙抗原夾心吸附基本達到飽和。因此，本著快速簡便的原則，選擇檢測時間為加樣后15 min。

2.2 檢測結果的判讀 加樣后，由于液體向前移動，先后與包被在T線和C線上的抗原形成復合物，這時試紙條經熒光檢測設備掃描顯示出2條熒光帶。C線熒光掃描值基本一致，T線值隨加樣中抗體濃度的增加而升高。相應的檢測結果以濃度為橫坐標，熒光值信號為縱坐標，經對數函數數據處理程序擬合得到標準曲線。當樣本為陰性時，PRRSV抗體濃度很低，T線熒光值很低或完全檢測不到；當樣本為陽性時，PRRSV抗體濃度越高，T線熒光值也越高。無論是陽性還是陰性結果，C線總能顯示熒光，如果C線沒有熒光顯現，無論T線有無，這時的結果均判為無效。

2.3 特異性試驗 本次用PRRSV蛋白和全病毒建立的PRRS-LFICA試劑盒檢測7種常見豬病的陽性血清，熒光比值均低于0.40（表1），呈陰性反應。表明該方法與7種常見豬病陽性血清不發(fā)生交叉反應，顯示出很好的特異性。

表1 特異性試驗結果

2.4 敏感性試驗 檢測PRRSV標準陽性血清，當血清稀釋至1∶1 024時，熒光檢測仍為陽性，用同一份陽性血清同時進行ELISA檢測，其效價為1∶64，可見用PRRS-LFICA試劑盒檢測比用ELISA檢測高1～2個滴度，表明該試劑盒的敏感性較好。

2.5 重復性試驗 批內重復性試驗的變異系數小于10%（表2），批間重復性試驗的變異系數也小于10%（表3）。表明PRRS-LFICA試劑盒具有良好的重復性。

表2 批內重復性試驗結果

表3 批間重復性試驗

2.6 比較試驗 分別用PRRS-LFICA試劑盒和ELISA試劑盒檢測臨床樣品200份，比較兩種方法的符合率。結果得出：PRRS-LFICA試劑盒檢出陽性180份，陰性20份，ELISA檢出陽性183份，陰性17份，兩種檢測方法的總符合率為91.5%（表4）。

表4 比較試驗結果

2.7 試劑盒保存期試驗 如表5所示，PRRS-LFICA試劑盒在保存480 d后檢測陽性血清、陰性血清，其變異系數均小于10%，說明該診斷試劑盒在保存12個月后仍然穩(wěn)定有效，進一步的穩(wěn)定性試驗還在進行中。

2.8 現場應用試驗 使用本次研制的PRRSLFICA試劑盒檢測四川省內各地市送檢的樣本2 336份，檢出血清抗體陽性2 087份，陽性率為89.34%。

3 結論與分析

3.1 鑭系熒光免疫層析方法（LFICA）是在時間分辨熒光免疫分析（TRFIA）基礎上建立起來的一種超微量快速免疫檢測技術，它集合了酶標記技術、放射標記技術和同位素標記技術的優(yōu)點，具有靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好、無污染，且測定范圍寬，試劑盒壽命長，操作簡單和無放射性等優(yōu)點。在人醫(yī)學界已有文獻報道，在獸醫(yī)學領域才起步，需要研究的內容和范圍還很多［6-7］。

3.2 本研究采用鑭系元素銪（Eu）作為熒光物質，與傳統(tǒng)熒光物質相比，銪具有獨特的熒光光譜特性：Stokes位移大、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、熒光壽命很長［8］，由此建立的熒光方法特異性更強，敏感性更高，檢測結果更加準確可靠。熒光納米微球的大小和均勻度也是重要的影響因素，本試驗用的微球粒徑為70～200 nm。微球表面經過羧基（或氨基）活化處理，易與蛋白或抗體牢固地結合，提高標記物的穩(wěn)定性。微球表面積比大，可以提高蛋白質的包被量，提升標記效率，從而大大提高試紙條的靈敏度。

表5 保存期試驗結果

3.3 在豬藍耳病抗體的常用檢測方法中，ELISA是目前應用最廣、發(fā)展最快的免疫檢測技術，具有敏感性和特異性強、操作簡單、檢測相對快速、檢查微量、無輻射、高通量等優(yōu)點，但需要比較完備的實驗設備，操作人員需要有一定的專業(yè)技術水平和經驗，檢測一批樣品的整個流程至少需要2～4 h，對于基層獸醫(yī)站和一般的養(yǎng)殖場不適用。膠體金免疫層析法（GICA）是近幾年來發(fā)展起來的一種快速檢測方法，操作簡單方便，不需要特殊儀器設備，但敏感性、重復性不高，產品質量參差不齊，漏檢率和誤診率較高。本研究建立的PRRS-LFICA方法，既具有膠體金免疫層析法簡單方便、適于基層等優(yōu)點，又具有ELISA敏感、特異、微量等優(yōu)點，克服了各自的缺點，與ELISA試劑盒檢測結果的符合率和敏感性都在90%以上。綜合分析表明，PRRS-LFICA試劑盒完全可以用于PRRS免疫抗體的快速檢測。