不同毒株豬偽狂犬病活疫苗的穩(wěn)定性和體液免疫效果評價

陳弟詩 ，周遠成，陳斌，周麗媛，裴超信，張毅，李麗，丁夢蝶

（1.四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041；2.畜禽生物制品四川省重點實驗室，四川 成都 610200）

豬偽狂犬病毒（PRV）是皰疹病毒科α皰疹病毒亞科的雙鏈DNA 病毒，基因組全長約150 kb。PRV 可感染多種動物，以發(fā)熱、奇癢（豬除外）、繁殖障礙、呼吸道癥狀和腦脊髓炎為主要特征。豬是PRV最主要的天然宿主和儲存宿主，PRV 感染后的臨床癥狀與豬的年齡、免疫狀態(tài)及毒株毒力密切相關，通常情況下易感豬群年齡越小，感染后的發(fā)病率和死亡率越高，無母源抗體的幼齡仔豬感染后死亡率甚至高達100%[1-2]。PRV具有嗜神經特性，通過不同途徑感染均可沿神經通路傳播，定植于三叉神經節(jié)而終身帶毒，在豬免疫力下降、藥物刺激或應激條件下，潛伏的PRV可被激活重新復制并向環(huán)境中排出病毒[3]。目前很多國家已經成功根除該病，而我國一直存在著PRV的感染和流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了很大的經濟損失。

偽狂犬病尚無特效藥物可以治療，疫苗免疫是防控該病最經濟有效的方法。目前，市場上有多種疫苗可供選擇，包括滅活疫苗、自然缺失弱毒活疫苗和人工基因缺失弱毒活疫苗等。鑒于PRV的嗜神經傳播特性，活疫苗才是防控偽狂犬病的首選疫苗，雖然國內有滅活疫苗的推廣，但滅活疫苗必須配合活疫苗的使用方能達到理想的效果，因此活疫苗的免疫效力是偽狂犬病免疫成功的關鍵。為評價臨床上不同毒株偽狂犬病活疫苗的穩(wěn)定性和免疫效力，本試驗選擇了市場上多個毒株的活疫苗包括Bartha K61株（進口和國產）、C 株、SA215 株、HB98 株、HB2000 株進行比較研究。希望通過不同毒株免疫效果的比較，為臨床上豬偽狂犬病活疫苗的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒種、細胞與抗體檢測試劑盒 豬偽狂犬病活疫苗Bartha K61 株（進口）、Bartha K61 株（國產）、C 株、SA215株、HB98株、HB2000株，均購于相應生產或代理企業(yè)，所購疫苗去除標簽后隨機標記為A、B、C、D、E、F。PRV gE 蛋白、gB 蛋白抗體ELISA檢測試劑盒購于IDEXX，PRV XJ株由四川農業(yè)大學動物生物技術中心分離鑒定，MDBK細胞由畜禽生物制品四川省重點實驗室保存提供。

1.2 實驗動物 40 頭體重相近、臨床表現(xiàn)正常的DLY（杜洛克×長白×約克夏）斷奶仔豬，購于四川省眉山市某豬場。所有仔豬均飼養(yǎng)于畜禽生物制品四川省重點實驗室的動物房，嚴格在隔離條件下飼養(yǎng)。

1.3 不同疫苗的穩(wěn)定性測試 將疫苗A～F 分別用配套疫苗稀釋液按照瓶簽標注頭份數(shù)稀釋，稀釋后立即取稀釋疫苗接種生長良好的MDBK 細胞，測定病毒含量；剩余疫苗在常溫下存放，1、2、3、4 h 后分別取樣測定病毒含量。添加病毒液于37 ℃5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)96 h，觀察細胞病變情況，使用Reed-Muench法計算結果。

1.4 免疫方案 將40頭仔豬隨機分為8組，每組5 頭，隔離飼養(yǎng)7 d，觀察無異常癥狀后分別免疫A、B、C、D、E、F疫苗（標記為1～6組），第7組免疫含有PBS稀釋液的偽狂犬病活疫苗D（標記為DPBS組），第8組不免疫作為陰性對照。

免疫前和免疫后7、14、21、28 d 分別采集前腔靜脈血，使用PRV gE 和gB 蛋白抗體試劑盒分別測定gE和gB抗體。選擇免疫后28 d采集的血清樣品，用RPV XJ株或其他毒株按照《中華人民共和國獸藥典》附錄記載的方法測定中和抗體，并記錄結果。

2 試驗結果

2.1 不同毒株偽狂犬病活疫苗稀釋后的穩(wěn)定性測試結果 所有立即稀釋的疫苗病毒含量均大于105.5TCID50/頭份，個別疫苗含量高達106.57TCID50/頭份（結果見表1）。使用疫苗配套的稀釋液稀釋后于常溫下放置不同的時間，測得不同疫苗株的穩(wěn)定性差別較大。進口豬偽狂犬病活疫苗和個別國產疫苗在稀釋后2 h 內穩(wěn)定，大部分國產疫苗稀釋后2 h 內病毒含量均有下降，某國產活疫苗稀釋后1 h 的病毒含量下降達50%，稀釋后4 h病毒含量僅為稀釋前的14.79%，但所有疫苗稀釋后4 h的病毒含量均高于105.2TCID50/頭份，參照國內標準（豬偽狂犬病活疫苗的病毒含量為105.0TCID50/頭份），所有疫苗均符合質量要求。

表1 不同毒株偽狂犬病活疫苗稀釋后的穩(wěn)定性比較

2.2 不同毒株偽狂犬病活疫苗免疫后gE 和gB ELISA 抗體的測定結果 使用PRV gB 和gE蛋白抗體ELISA試劑盒分別測定8組仔豬在免疫前和免疫后不同時間點采集的血清抗體，結果得出所有仔豬的gE 抗體均為陰性，所有仔豬在免疫后7 d的gB抗體均為陽性，在28 d內S/N值不斷降低，不同疫苗間gB 抗體的變化趨勢一致，通過測定的S/N值比較，不同疫苗間差異不顯著（圖1）。

2.3 中和抗體效價的測定結果 免疫后28 d，采集所有仔豬血清，使用新分離的偽狂犬病毒基因2型變異株XJ株進行中和抗體效價測定，結果見表2。

分別使用不同毒株進行中和抗體試驗，發(fā)現(xiàn)6 種市售疫苗除F 外，其余疫苗免疫后28 d 對PRV 2 型變異株XJ 株的中和抗體均較低。在臨床中某些疫苗攜帶有專用的免疫增強劑型稀釋液，為驗證專用稀釋液能否提高疫苗免疫后的中和抗體水平，本試驗選擇自帶專用稀釋液的疫苗D 進行測定，分別使用疫苗D 自帶的專用稀釋液和常規(guī)PBS 緩沖液按說明稀釋，然后免疫仔豬。免疫后28 d 采集專用稀釋液免疫組和常規(guī)PBS 稀釋液免疫組的仔豬血清，分別使用疫苗D和PRV XJ 株進行中和抗體的測定。結果顯示：疫苗D無論是使用常規(guī)PBS液稀釋還是使用專用稀釋液稀釋，其針對PRV 2型XJ株的中和抗體效價均低于10，但均能產生針對本疫苗的中和抗體。使用含免疫增強劑的專用稀釋液稀釋的D疫苗在免疫仔豬28 d后，中和抗體效價平均值為37.05，而使用PBS稀釋液組的中和抗體效價平均值為28.93，前者明顯高于后者?？梢娨呙鏒雖然能夠誘導針對自身的高效價中和抗體，但是無論是否使用免疫增強劑，均不能誘導針對豬偽狂犬病毒2型XJ株的等效中和抗體。

圖1 不同毒株偽狂犬病活疫苗免疫后gB抗體的測定結果

表2 不同毒株豬偽狂犬病活疫苗免疫后28 d血清中和抗體效價的測定結果

3 討論

豬偽狂犬病毒具有皰疹病毒的典型特征，感染豬后可以潛伏在豬外周神經組織中形成隱性感染，在免疫抑制性藥物、應激條件或某些疾病感染等因素的刺激下會誘發(fā)PRV 的再次復制和排毒[4]。隱性感染豬的排毒可能會對豬群造成很大的經濟損失，經濟損失的多少取決于豬群的群體免疫力。在豬偽狂犬病防控中，綜合考慮經濟效益和凈化成本，豬場需要選擇是執(zhí)行免疫凈化的策略還是免疫防控的策略。無論如何選擇，當前形勢下對PRV 疫苗的合理選擇和使用始終是防控偽狂犬病的關鍵。因此，如何去評價當前臨床上使用的各種豬偽狂犬病活疫苗顯得尤為重要。

3.1 豬偽狂犬病活疫苗的免疫效果評價 對疫苗效果的評價主要從免疫學效果和安全性兩方面入手。安全性評價可以通過觀察免疫后豬群的群體表現(xiàn)來得到比較直觀的結果。免疫學效果通常采用血清學方法或攻毒保護實驗進行評價，多數(shù)疫苗的血清學抗體指標與攻毒保護率呈正相關。在臨床條件下使用攻毒實驗去評價豬偽狂犬病活疫苗是否對田間野毒株有效，可能會導致散毒而對豬場造成毀滅性的打擊，因此使用血清學方法更為簡單有效。血清學評價手段可以采用ELISA 測定免疫抗體，或者采用血清中和實驗測定中和抗體。由于中和抗體測定需要一定的實驗條件，而多數(shù)實驗室不具備這些條件，因此臨床上更多的是通過ELISA 來監(jiān)控疫苗免疫效果。

本試驗選擇了6種不同毒株的常用疫苗來免疫仔豬，然后分別使用ELISA 和中和抗體測定兩種方法來進行豬偽狂犬病活疫苗的免疫學效果評價，結果發(fā)現(xiàn)不同疫苗免疫后ELISA 抗體的產生規(guī)律基本一致，組間無顯著性差異；而使用當前流行毒株XJ株進行中和抗體測定后發(fā)現(xiàn)，市售的大多數(shù)疫苗在免疫后28 d 并不能誘導針對XJ株的高效價中和抗體。因此，針對豬偽狂犬病活疫苗的免疫學效果評價，只有在使用當前流行毒株進行中和抗體測定后才能篩選到優(yōu)秀的豬偽狂犬病活疫苗。

3.2 豬偽狂犬病活疫苗的穩(wěn)定性評價 隨著動物生物制品生產工藝的革新，科研人員開發(fā)出了多種耐熱保護劑，耐熱保護劑的出現(xiàn)使得疫苗在運輸和使用過程中可以耐受更高的環(huán)境溫度，與普通凍干保護劑相比，耐熱保護劑在37 ℃下依然能夠長時間地維持凍干疫苗滴度不發(fā)生變化，使得疫苗的運輸和使用更為方便。但到目前為止，人們只關心耐熱保護劑或常規(guī)保護劑在凍干狀態(tài)下對疫苗的保護能力，而缺乏對凍干疫苗稀釋后穩(wěn)定性的研究。本試驗選擇了多種臨床上常用的豬偽狂犬病毒凍干活疫苗，對其稀釋后的穩(wěn)定性進行了測試，分別使用疫苗自帶的稀釋液按照使用說明書進行稀釋，稀釋后于不同時間點取樣測定不同毒株偽狂犬病活疫苗中的病毒含量，結果顯示：不同疫苗稀釋后的穩(wěn)定性有差異，隨著稀釋時間的延長病毒含量持續(xù)下降，部分耐熱保護劑活疫苗稀釋后1 h 的病毒含量下降約50%，稀釋4 h后部分疫苗病毒含量下降最高可達85.21%。這提示人們在使用疫苗時需要現(xiàn)配現(xiàn)用，不宜久置，也提示疫苗研發(fā)人員在關注凍干保護劑耐熱能力的同時，還應關注凍干疫苗稀釋后的穩(wěn)定性。