果蔬和谷物制品中多菌靈的免疫檢測

柳 雙 ，謝春花 ，王敏思 ，張志軍 ，宋 洋

（1. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387； 2 . 天津師范大學(xué)天津市動植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387；3. 國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心（天津），天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384）

多菌靈（Carbendazim），即 N-（2-苯并咪唑基）-氨基甲酸甲酯，是一種廣譜內(nèi)吸性的苯并咪唑類殺菌劑，因其具有高效、低毒、內(nèi)吸的特點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛[1-3].近年來，由于多菌靈超范圍、超劑量使用的現(xiàn)象普遍存在，再加上不易被降解，導(dǎo)致農(nóng)畜產(chǎn)品中多菌靈殘留超標(biāo)問題嚴(yán)重[4-5].各種動物毒理實(shí)驗(yàn)證實(shí)，一定劑量的多菌靈可能會引起動物的肝臟、生殖器官、分泌器官、免疫系統(tǒng)等的異常病理現(xiàn)象[6-7].多菌靈的過量使用也會影響作物產(chǎn)量、色素含量及營養(yǎng)價值等[8].目前，多菌靈在中國和歐盟多個國家（地區(qū)）被允許使用，由于其具有慢性毒性，因此國際食品法典委員會和中國（GB2763—2014）規(guī)定了食品中多菌靈的限量標(biāo)準(zhǔn).其中，食莢豌豆、番茄、黃瓜、桃、蘋果、橙子的最大殘留限量（MRL）分別為 0.02、3.00、0.50、2.00、3.00、0.50 mg/kg.歐盟規(guī)定多菌靈在新鮮菇類中的MRL 為0.1 mg/kg[9]，韓國和英國規(guī)定多菌靈在食用菌中的MRL 為1 mg/kg，日本規(guī)定為3 mg/kg[10].目前，食品中多菌靈的定量仍以儀器法為主，主要是利用光譜技術(shù)和色譜技術(shù).雖然隨著儀器設(shè)備的改進(jìn)以及實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，這些儀器方法的準(zhǔn)確度和檢出限逐漸降低（由mg/kg 到μg/kg），但也存在著儀器成本高、自動化程度低等問題.近年來，簡單、快速的新型免疫化學(xué)分析方法逐步建立并得以廣泛應(yīng)用[11-12].

酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）通過抗原抗體特異性反應(yīng)和酶催化底物顯色反應(yīng)的結(jié)合，將微量待測物信號轉(zhuǎn)化成酶的催化信號，由于酶的催化活性明顯高于化學(xué)催化劑的催化活性，因此反應(yīng)信號被放大，達(dá)到了檢測痕量物質(zhì)的目的[13-15].如Uclés 等[16]建立了競爭ELISA 方法檢測葡萄和葡萄酒中的多菌靈、 抑菌唑和噻菌靈殘留，該方法的線性范圍為10.0～80.0 μg/kg；Yan 等[17]基于氨基甲酸酯單克隆抗體建立ELISA 法，用以檢測蘋果、黃瓜、西紅柿中的多菌靈含量，工作范圍為0.06～7.47 ng/mL.這些研究實(shí)現(xiàn)了多菌靈的靈敏檢測.

本研究基于多菌靈多克隆抗體，經(jīng)過簡單快速的前處理過程和反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了蔬菜、果汁和谷物中多菌靈殘留的直接競爭ELISA 檢測方法（CDELISA），并用傳統(tǒng)的高效液相色譜法對其進(jìn)行驗(yàn)證，最后采用該方法對香菇、小麥、黃瓜、橙子、橙汁的30個樣品進(jìn)行了實(shí)際樣品檢測.

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

儀器：全波長酶標(biāo)儀（Labsystems），美國雷勃公司；96 孔酶標(biāo)板，丹麥Nunc 公司；高效液相色譜儀，美國Agilent Technologies 公司；多功能食品加工機(jī)，中國帥佳電子科技有限公司.

試劑：多菌靈，加拿大TRC 公司；過氧化氫脲、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），美國 Sigma 公司；PSA 吸附劑（40～60 μm），美國 Sepax Technologies，Inc公司；牛血清白蛋白（BSA）、β-環(huán)糊精，德國Merck 公司；二甲基亞砜（DMSO），J&K 公司；酶標(biāo)二抗（羊抗兔，5000），上海斯信生物技術(shù)有限公司； 硫酸（分析純）、冰醋酸（色譜純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），天津市化學(xué)試劑供銷公司；多菌靈多克隆抗體、多菌靈包被原（半抗原與雞卵白蛋白的耦聯(lián)化合物），本課題組合成.

pH 值為9.6 的碳酸鈉緩沖液（包被緩沖液），磷酸氫二鉀溶液（0.066 mol/L, pH 為 9.0），PBS（0.01 mol/L磷酸鈉緩沖液，pH = 7.4），PBST（1 L PBS 加 0.5 g 吐溫），PBSB（100 mL PBS+0.1 g BSA）.

1.2 多菌靈CD-ELISA 方法的建立

不同反應(yīng)條件對ELISA 中抗原抗體的特異性識別和酶與底物的顯色放大反應(yīng)均有不同程度的影響，甚至是阻止反應(yīng)進(jìn)行，考慮到參與反應(yīng)的抗體和酶所具備的特性，一般影響較大的反應(yīng)條件有溶液的離子濃度、pH 值以及有機(jī)試劑的含量等.本研究對這些反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化.

1.2.1 酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

利用CD-ELISA 法，抗體包被量為每孔1 μg，用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長（450 nm 和650 nm）檢測，選擇吸光度在0.8～1.2 間的酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)為最優(yōu)[18]. 具體操作步驟如下.

①包被：抗體包被量為每孔1 μg，37 ℃下孵育3 h，PBST 沖洗 3 次；②封閉：每孔中加入 200 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的脫脂奶粉，室溫靜置1 h，PBST 沖洗4 次；③競爭實(shí)驗(yàn)：空白孔加入100 μL PBS，實(shí)驗(yàn)組分別加入3 倍梯度稀釋的酶標(biāo)抗原100 μL，室溫孵育1 h，PBST 沖洗 5 次；④顯色：每孔加入底物液 150 μL，避光室溫靜置15 min 后，加入終止液終止反應(yīng)；⑤測定吸光度.

1.2.2 抗體包被量的優(yōu)化

設(shè)置酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)為1.2.1 中優(yōu)化的最佳稀釋倍數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)品多菌靈的質(zhì)量濃度分別為0.042、0.128、0.640、1.600、3.200、6.400 μg/kg，選擇 IC50值最低時的抗體包被量為最優(yōu)[18].具體操作步驟如下.

①包被：抗體包被量分別為每孔 0.5、1.0、2.0 μg，37 ℃恒溫孵育 3 h，PBST 沖洗 3 次；②封閉：操作方法同 1.2.1；③競爭實(shí)驗(yàn)：A 行的孔（空白孔）加入 100 μL PBS，B 行的孔（對照孔）加入 50 μL PBS 和 50 μL 以最佳稀釋倍數(shù)稀釋的酶標(biāo)抗原，C～H 孔加入50 μL 酶標(biāo)抗原和50 μL 多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液（從低濃度到高濃度），室溫孵育1 h 后，PBST 沖洗5 次；④、⑤步驟同1.2.1節(jié).

1.2.3 緩沖液條件的優(yōu)化

配制緩沖液，使其離子濃度分別為 10、20、30、40、50 mmol/L，pH 值分別為 4.5、5.5、6.5、7.4、8.5、9.5，用以稀釋酶標(biāo)抗原和多菌靈.反應(yīng)在96 孔酶標(biāo)滴定板中進(jìn)行，用酶標(biāo)儀讀取A450和A650數(shù)值，最后根據(jù)結(jié)果中IC50值的大小和吸光度的變化選擇最佳反應(yīng)條件.

1.2.4 多菌靈CD-ELISA 方法的建立

利用以上優(yōu)化條件，將多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度分別為 0.042、0.128、0.640、1.600、3.200、6.400、12.800、25.600 μg/kg 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行 CD-ELISA實(shí)驗(yàn).以多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（μg/kg）為橫坐標(biāo)，以抑制率（%）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

抑制率（IC）=[（Acontrol-Ax）/（Acontrol-A空白）]×100%式中：Acontrol為標(biāo)準(zhǔn)品濃度為零時的吸光度；Ax為標(biāo)準(zhǔn)品濃度為x 時的吸光度；A空白為空白孔的吸光度.

1.3 抗體特異性的評估

通過抗原及其結(jié)構(gòu)類似物與抗體的交叉反應(yīng)率（CR）來判斷抗體的特異性[19-20]. 本研究選用的抗原結(jié)構(gòu)類似物包括：苯菌靈（Benomyl）、托布津（Thiophanate）、速滅威（MTMC）、2-氨基苯并咪唑（2-Aminobenzimidazole）、噻苯咪唑（Thiabendazole）、甲基硫菌靈（Thiophanate-Methyl）.

CR（%）=[IC50（多菌靈）/IC50（compound）]×100式中：IC50為抑制率為50%對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度.

1.4 消除基質(zhì)影響

樣品中的一些化合物，如色素、鹽、糖等都可能影響抗原抗體的結(jié)合或抑制酶的活性[19].一般情況下，簡單稀釋就足以消除基質(zhì)影響，而且稀釋倍數(shù)的增大通常都伴隨著基質(zhì)影響的減小，但考慮到方法的檢測限（LOD）和靈敏度，稀釋倍數(shù)不能太大[20].因此，在保持稀釋倍數(shù)盡可能小的情況下，使用一些掩蔽劑（PSA）或表面活性劑（Tween-20）來減小基質(zhì)的影響和提高方法靈敏度.為了盡可能減小基質(zhì)影響，本研究對基質(zhì)的稀釋倍數(shù)、掩蔽劑和表面活性劑的用量進(jìn)行優(yōu)化.

1.5 CD-ELISA 方法評估的樣品準(zhǔn)備

分別選擇水果（橙子）、果汁（橙汁）、蔬菜（黃瓜）、谷物（小麥）和食用菌（香菇）為樣品評估CD-ELISA 方法的各項性能指標(biāo)，樣品均來自天津當(dāng)?shù)厥袌?在添加回收實(shí)驗(yàn)前，每個樣品都通過高效液相色譜法檢測確保其不含有多菌靈和苯菌靈.將樣品的可食用部分用食品加工機(jī)切碎，儲存在-20 ℃下備用.

1.6 樣品前處理和高效液相色譜檢測

1.6.1 CD-ELISA 檢測的樣品處理

（1）固體樣品：稱取1 g 經(jīng)勻漿預(yù)冷的樣品，加入0.4 g 無水硫酸鈉、0.1 g 無水乙酸鈉、1 mL 醋酸和乙腈混合液（體積比為 1 ∶99），震蕩 2 min，離心（6 000 r/min，4 ℃）3 min.取上清液加入 0.02 g PSA 吸附劑，渦旋 30 s，離心（6 000 r/min，4 ℃）3 min，取上清液.

（2）液體樣品：取 1 mL 預(yù)冷的樣品，加入 1 mL 體積分?jǐn)?shù)為1%的酸化乙腈，震蕩2 min，加入0.1 g 無水硫酸鈉、0.025 g 無水乙酸鈉、0.025 g 氯化鈉和0.02 g PSA 吸附劑，渦旋 30 s，離心（6 000 r/min，4 ℃）3 min，取上清液.

處理后的樣品儲存于棕色小瓶中，置于-20 ℃下備用，用緩沖液稀釋即可進(jìn)行CD-ELISA 檢測.

1.6.2 高效液相色譜檢測的樣品處理

（1）固體樣品：處理方法參考文獻(xiàn)[21].稱取40 g 經(jīng)勻漿預(yù)冷的樣品，加入16 g 無水硫酸鈉、2 g 無水乙酸鈉和40 mL 體積分?jǐn)?shù)為1%的酸化乙腈，震蕩2 min，4 ℃下靜置15 min.取上清液加入0.8 g PSA 吸附劑和3.2 g無水硫酸鈉，渦旋 30 s，離心（6 000 r/min，4 ℃）3 min，取15 mL 上清液，45 ℃下減壓旋蒸至1 mL.

（2）液體樣品：取40 mL 預(yù)冷的樣品，加入40 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的酸化乙腈，震蕩2 min，加入0.8 g PSA 吸附劑、8 g 無水硫酸鈉、2 g 氯化鈉和 2 g 無水乙酸鈉，渦旋 30 s，離心（6 000 r/min，4 ℃）3 min，取 15 mL上清液，45 ℃下減壓旋蒸至1 mL.

處理后的樣品儲存于棕色小瓶中，-20 ℃?zhèn)溆?，?jīng)0.22 μm 濾膜過濾后用以檢測.

1.6.3 高效液相色譜的檢測條件

高效液相色譜儀為安捷倫1200 系列，C18 柱（250 mm×4.6mm，5μm）.反應(yīng)條件：進(jìn)樣體積為20μL，流速為1.0 mL/min，波長為286 nm，流動相為甲醇和水的等體積混合物.最終以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出線性回歸方程.

1.7 添加回收實(shí)驗(yàn)和實(shí)際樣品檢測

評價準(zhǔn)確度的方法有標(biāo)樣對照實(shí)驗(yàn)、方法對照實(shí)驗(yàn)和添加回收實(shí)驗(yàn)[22].本研究利用添加回收實(shí)驗(yàn)評估CD-ELISA 的準(zhǔn)確度.分別對橙子、橙汁、黃瓜、小麥以及香菇這5 種食物的樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)（經(jīng)檢驗(yàn)不含多菌靈和苯菌靈），每種樣品分別添加3 個濃度（10、20、40 μg/kg），每個濃度重復(fù) 3 次.樣品提取液經(jīng)CDELISA 法分別檢測后，計算其回收率（Recovery rate），根據(jù)回收率接近100%的程度來檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度.

回收率（%）=（測定值-空白值）/添加量×100

對橙子、橙汁、黃瓜、小麥及香菇進(jìn)行抽樣調(diào)查，每種抽取6 個樣品進(jìn)行多菌靈殘留的檢測.

2 結(jié)果與分析

2.1 CD-ELISA 法的建立

本研究確定CD-ELISA 法的最優(yōu)條件為：酶標(biāo)抗原稀釋300 倍，抗體包被量為每孔0.5 μg，磷酸緩沖液濃度為10 mmol/L，pH 值為7.4，抗原抗體競爭反應(yīng)時間為30 min.多菌靈標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示.由圖1 可以看出，多菌靈質(zhì)量濃度與抑制率呈正比，IC15=（0.30 ±0.08）μg/L，IC50=（2.00 ± 0.57）μg/L.

圖1 多菌靈標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Carbendazim standard curve

2.2 抗體特異性的評價

利用CD-ELISA 法測定抗體與多菌靈及其結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)來評價抗體的特異性，結(jié)果如表1所示.

表1 化合物與抗體的交叉反應(yīng)率和IC50 值Tab.1 IC50 and CR of compounds and antibody

由表1 可以看出，該抗體可以特異性地識別多菌靈，與苯菌靈也有較高的交叉反應(yīng)率（CR=56.80%），這可能是因?yàn)楸骄`的有效成分就是多菌靈；抗體與硫菌靈和甲基硫菌靈的CR 分別為3.90%和2.10%，可能是由于二者具有2 個長鏈的與苯并咪唑環(huán)相似的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，因此與抗體有一定的親和性；與其他苯并咪唑類和氨基甲酸甲酯類化合物的CR 小于0.25%.

2.3 CD-ELISA 的校正曲線及基質(zhì)曲線

多菌靈校正曲線的最優(yōu)制備條件為：抗體包被量為每孔0.5 μg，封閉時間為60 min，多菌靈標(biāo)品（0.042、0.128、0.640、1.600、3.200、8.000、16.000、80.000 μg/L）和酶標(biāo)抗原（稀釋300 倍）的稀釋液為含有0.5%吐溫-20 的 PBS（10 mmol/L，pH 7.4），抗原抗體競爭反應(yīng)時間為30 min，檢測過程僅需要2 h.繪制校正曲線，線性范圍為0.4～580.0μg/L，即抑制率為20%～80%所對應(yīng)的多菌靈濃度，IC15=（0.30±0.15）μg/L，IC50=（2.70±0.30）μg/L.

將香菇、小麥、橙汁、橙子和黃瓜樣品提取液經(jīng)PBSB 稀釋20 倍后的溶液作為酶標(biāo)抗原和多菌靈標(biāo)品的稀釋液，經(jīng)CD-ELISA 檢測獲得的抑制率曲線即為樣品的基質(zhì)曲線，結(jié)果如圖2 和表2 所示.

圖2 多菌靈CD-ELISA 校正曲線及基質(zhì)曲線的比較（以香菇、橙子為例）Fig.2 Comparison of calibration curves and matrix curves of CD-ELISA（taking mushroom and orange as examples）

表2 多菌靈CD-ELISA 法校正曲線與各樣品基質(zhì)曲線的比較Tab.2 Comparison between calibration curve and matrix curves of carbendazim in CD-ELISA %

5 種樣品的基質(zhì)曲線與校正曲線幾乎重合，由此可知，樣品的前處理方法完全可以達(dá)到消除基質(zhì)影響的目的，且該校正曲線至少可以用于這5 種樣品的多菌靈殘留檢測.

2.4 CD-ELISA 法各項指標(biāo)的評估

2.4.1 檢測限和靈敏度

在CD-ELISA 方法中，檢測限是IC15，即抑制率為15%時所對應(yīng)的待測物中多菌靈的濃度，靈敏度是IC50，即抑制率為50%時所對應(yīng)的待測物中多菌靈的濃度.根據(jù)多菌靈CD-ELISA 的校正曲線可知，檢測限為（0.30±0.15）μg/L，靈敏度為（2.70±0.30）μg/L.

2.4.2 添加回收實(shí)驗(yàn)

對不含多菌靈的橙汁、橙子、黃瓜、香菇和小麥樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3 所示.

表3 多菌靈在5 種樣品中的添加回收率Tab.3 Recovery rates of carbendazim in five kinds of samples by CD-ELISA

由表3 可以看出，5 種樣品的提取液經(jīng)CD-ELISA法分別檢測后，回收率為84.3%～112.7%，變異系數(shù)（CV）小于12.3%.

2.4.3 高效液相色譜法與CD-ELISA 法的對照

根據(jù)高效液相色譜法得到多菌靈的線性回歸方程y=49.627x+2.524 4，相關(guān)系數(shù)為0.999 9.以香菇和小麥為材料，分別采用HPLC 和CD-ELISA 的前處理方法對樣品進(jìn)行處理后，同時用2 種方法進(jìn)行檢測，結(jié)果如表 4 和圖 3 所示.其中，CD-ELISA 法的 回收率為89.7%～112.7%，平均為99.7%，變異系數(shù)低于11.0%；HPLC 法的回收率為 79.3%～104.9%，平均為95.5%，變異系數(shù)低于4.8%.雖然CD-ELISA 法回收率的集中程度略低于HPLC 法，但更接近100%.從圖3可以看出，2 種方法的檢測結(jié)果呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9933，說明二者具有較高的一致性，即檢測多菌靈殘留的新方法CD-ELISA 具有接近國標(biāo)儀器法的準(zhǔn)確度，能被應(yīng)用于食品中多菌靈殘留的快速檢測.

表4 CD-ELISA 法與HPLC 法的比較Tab.4 Comparison between CD-ELISA and HPLC %

圖3 HPLC 與CD-ELISA 的結(jié)果相關(guān)性Fig.3 Correlation between HPLC and CD-ELISA

2.5 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

對天津市場的橙子、橙汁、黃瓜、小麥及香菇進(jìn)行抽樣調(diào)查，每種抽取6 個樣品進(jìn)行多菌靈殘留的檢測，結(jié)果如表5 所示.由表5可以看出，小麥和香菇的多菌靈檢出率較高，均達(dá)到50%，但小麥6 個樣品中的多菌靈含量均較低，香菇的含量較高，多菌靈超標(biāo)率達(dá)到16.67%； 橙子和黃瓜的檢出率分別為16.67%和33.33%，黃瓜有2 個樣品的多菌靈含量較高，但未超標(biāo).橙汁的檢出率和超標(biāo)率均為0.多菌靈對所有樣品的整體檢出率為30%，超標(biāo)率為3.33%.

表5 實(shí)際樣品中多菌靈的檢測Tab.5 Detection of carbendazim in actual samples

3 結(jié)語

本研究基于多菌靈多克隆抗體，建立了快速、高效、靈敏的CD-ELISA 法，用以檢測食品中多菌靈的殘留.最終確定多菌靈CD-ELISA 校正曲線的最優(yōu)制備條件為：抗體包被量為每孔0.5 μg，酶標(biāo)抗原稀釋300 倍，多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品和酶標(biāo)抗原（稀釋300 倍）的稀釋液為含有 0.5 %吐溫-20 的 PBS（10 mmol/L，pH 7.4）. 樣品僅需經(jīng)過1 倍的酸化乙腈提?。ù姿岷鸵译娴捏w積比為1 ∶99），提取液用PBSB 緩沖液稀釋20 倍即可用于CD-ELISA 檢測.繪制的校正曲線：IC15=（0.30±0.15）μg/L，IC50=（2.70 ± 0.30）μg/L，線性范圍為 0.40～58.0 μg/L.整個檢測時間僅需2 h，達(dá)到了快速檢測的目的，滿足了國家對食品中多菌靈的限量標(biāo)準(zhǔn).因此，CD-ELISA法可以作為食品中多菌靈殘留的快速檢測手段.