多種皮損取材處理方式在診斷淺表皮膚真菌病的比較研究

胡記妹，謝志連，蔡浩川，葉愛君，吳丹婷

(南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院檢驗科，廣東廣州 510900)

淺表皮膚真菌病是由寄生于皮膚角蛋白組織的致病真菌所引起的皮膚病，包括頭癬、須癬、體股癬、手足癬、甲真菌病、花斑癬和馬拉色菌毛囊炎等皮膚科的常見病和多發(fā)病。病原性淺表真菌的生長喜好潮濕的環(huán)境，在此種環(huán)境，病菌繁殖迅速，人群易感染。從化地區(qū)是亞熱帶地區(qū)，一年中大部分時間氣候濕熱，特別適合真菌等微生物滋長，有六十多萬人口，以農(nóng)業(yè)人口為主，城鎮(zhèn)周邊有眾多民工，人口聚集，極易發(fā)生淺表皮膚真菌的感染，到醫(yī)院皮膚科就診的患者大幅增多，因此急需快速有效的實驗室檢測方法。實驗室皮膚真菌病的方法有直接鏡檢、真菌培養(yǎng)、或組織病理檢查，必要時進(jìn)行伍德燈檢查、共聚焦激光掃描顯微鏡檢查等，但除真菌鏡檢外，其他檢查方法設(shè)備要求過高，且耗時較長，并不適合于門診皮膚科開展的皮損檢查項目，因而直接鏡檢因其簡便、快速易開展而成為應(yīng)用最為普遍的真菌檢查方法。目前對實驗室真菌直接鏡檢取材及處理方法的研究不多，通常著眼于馬拉色菌鏡檢方法的研究，而對淺表皮膚癬病鏡檢方法的探討較少，未見文獻(xiàn)對鈍刀刮取法、膠布粘貼法及革蘭染色法3種取材處理方法的比較研究，尤其是革蘭染色法的研究更是少之又少。現(xiàn)對臨床擬診為花斑癬、馬拉色菌毛囊炎、體表皮膚癬病包括頭癬、須癬、體股癬、手足癬等的患者采用鈍刀刮取法、膠布粘貼法、革蘭染色法3種取材處理方式直接鏡檢，并用SPSS11.5軟件統(tǒng)計分析3種取材處理方式之間的差異在淺表性皮膚真菌病有無統(tǒng)計學(xué)意義，旨在為不同的淺表皮膚真菌病選擇最佳取材處理方法，從而提高直接鏡檢的陽性率和準(zhǔn)確率，為臨床診斷和治療作出肯定依據(jù)，高效快速地作出診斷報告[1-5]。

1 材料與方法

1.1病例來源 2016年3-4月161例到南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院門診部皮膚科就診的患者。其中男性68例，女性93例，年齡0～77歲。按臨床擬診病種分為花斑癬組、馬拉色菌毛囊炎組、體表皮膚癬病組，包括體股癬、手足癬、頭癬等皮膚科常見的皮膚病和多發(fā)病。

1.2材料 10%KOH水溶液，革蘭染色液，鈍化的手術(shù)刀，酒精燈，75%消毒酒精，透明膠布，顯微鏡等。

1.3取材及處理方法 對同一患者同時用鈍刀刮取10%KOH封片法、透明膠布粘貼10%KOH濕片法、鈍刀刮取革蘭染色法進(jìn)行直接鏡檢。

1.3.1采集標(biāo)本 采集標(biāo)本前應(yīng)對采集部位及采集用具進(jìn)行消毒，遵循無菌操作的規(guī)則，避免污染造成假陽性。采集部位可用清水清洗1遍，此舉可把皮膚上的藥物、護(hù)膚品、脂肪滴等雜物清洗干凈，以免影響鏡下觀察，然后用75%酒精初步消毒取材部位(所選的取材部位病灶面積要足夠大，足以提供3次的皮屑取材；取材部位要合適，一般來說應(yīng)選取新生的與完好皮膚相鄰的邊沿部位：對于花斑癬應(yīng)選取色淡與色深相間部位的皮屑；對于馬拉色菌毛囊炎應(yīng)選取帶有膿性分泌物的膿點(diǎn)，刮破膿點(diǎn)后取其滲液；對于體表皮膚癬病，體股癬應(yīng)取邊沿紅色病變部位且有較多鱗屑處，手足癬應(yīng)取潮濕的白色部位且有較多皮屑處等)。

1.3.2制片 先把鈍刃手術(shù)刀用酒精燈灼燒消毒，待冷卻后，輕輕在病變部位刮取一定量皮屑，置于已放好一滴10%KOH水溶液的載玻片上，蓋上蓋玻片，注意不要留有氣泡，否則影響觀察，然后過火固定，注意過火時間不要太長，否則載液沸騰蒸發(fā)，易出現(xiàn)太多結(jié)晶，也會影響鏡下的觀察；繼續(xù)用鈍刃手術(shù)刀刮取足夠量皮屑放于干凈的載玻片上，過火固定，干燥后用革蘭染色法快速染色，沖洗干凈染色液，注意沖洗時間不宜過長，流水量要小，否則會把菌絲和孢子沖洗掉而造成假陰性，待風(fēng)干后，用油鏡觀察；最后用透明膠布貼與皮損處，用手指按壓膠布，使其粘貼足夠量的皮屑，然后快速撕下，再把帶有皮屑的透明膠布貼于滴有一滴10%KOH水溶液的載玻片上，不用過火固定，注意貼平，防止有氣泡。

1.3.3顯微鏡觀察 采集完標(biāo)本并用3種方法制成玻片后，直接置于顯微鏡下觀察。先用低倍鏡在清晰的視野下找到孢子或菌絲(真菌菌絲和孢子具有折光性，標(biāo)本的雜質(zhì)經(jīng)10%KOH溶液溶解后，鏡下呈暗綠色熒光；圓筒形細(xì)胞沿長軸方向連接，前端邊分枝邊形成絲狀結(jié)構(gòu)的是菌絲，根據(jù)有無橫隔，菌絲又可分為有隔菌絲和無隔菌絲；孢子常呈圓形、卵圓形，出芽的孢子會形似葫蘆，形狀突出，也有鏈狀孢子的存在)，然后再換高倍鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，可微調(diào)細(xì)螺旋，菌絲和孢子會出現(xiàn)一層發(fā)光的夾膜；而經(jīng)革蘭染色的標(biāo)本應(yīng)用油鏡觀察，菌絲和孢子被染成紅色，而背景中的雜質(zhì)如細(xì)胞器、角質(zhì)細(xì)胞、脂滴、氣泡、纖維絲等均不著色，且其他附著力弱的雜質(zhì)也被沖洗掉，對比明顯，易于觀察。鏡下找到數(shù)個孢子或數(shù)條菌絲即可確定為陽性，對于疑似孢子或菌絲的歸位陰性結(jié)果。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，率的比較采用χ2檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.13種取材處理方法鏡檢檢測 對161例臨床疑似為花斑癬、馬拉色菌毛囊炎、體表皮膚癬病的患者進(jìn)行3種不同的標(biāo)本取材處理后，直接鏡檢結(jié)果見表1。

2.2疑似花斑癬患者鏡檢檢測 45例疑似花斑癬的患者鈍刀刮取10%KOH封片法直接鏡檢陽性者42例，陰性者3例，陽性率為93.3%；透明膠布粘貼法10%KOH濕片直接鏡檢陽性者40例，陰性者5例，陽性率為88.9%；鈍刀刮取革蘭染色法直接鏡檢陽性者44例，陰性者1例，陽性率為97.8%。將3種方法直接鏡檢的陽性率用χ2檢驗進(jìn)行兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 3種取材處理方法鏡檢結(jié)果

2.3疑似馬拉色菌毛囊患者鏡檢檢測 52例疑似馬拉色菌毛囊的患者鈍刀刮取10%KOH封片法直接鏡檢陽性者45例，陰性者7例，陽性率86.5%；透明膠布粘貼法10%KOH濕片直接鏡檢陽性者42例，陰性者10例，陽性率80.8%；鈍刀刮取革蘭染色法直接鏡檢陽性者52例，陰性者0例，陽性率為100.0%。將3種方法直接鏡檢的陽性率用χ2檢驗進(jìn)行兩兩比較，鈍刀刮取10%KOH封片法直接鏡檢陽性率高于透明膠布粘貼法10%KOH濕片直接鏡檢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；鈍刀刮取革蘭染色法直接鏡檢陽性率高于鈍刀刮取10%KOH封片法直接鏡檢、透明膠布粘貼法10%KOH濕片直接鏡檢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4疑似體表皮膚癬病患者鏡檢檢測 64例疑似體表皮膚癬病的患者鈍刀刮取10%KOH封片法直接鏡檢陽性者54例，陰性者10例，陽性率為84.4%；透明膠布粘貼法10%KOH濕片直接鏡檢陽性者44例，陰性者20例，陽性率為68.8%；鈍刀刮取革蘭染色法直接鏡檢陽性者33例，陰性者31例，陽性率為51.6%。將3種方法直接鏡檢的陽性率用χ2檢驗進(jìn)行兩兩比較，鈍刀刮取10%KOH封片法直接鏡檢陽性率均高于透明膠布粘貼法10%KOH濕片直接鏡檢、鈍刀刮取革蘭染色法直接鏡檢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；透明膠布粘貼法10%KOH濕片直接鏡檢陽性率高于鈍刀刮取革蘭染色法直接鏡檢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

近年來，隨著全球氣溫的上升及個人衛(wèi)生習(xí)慣、環(huán)境等因素的影響，淺表皮膚真菌病的發(fā)病率逐年升高，尤其是在亞熱帶及熱帶地區(qū)，因為潮濕溫暖的氣候，特別利于病原性真菌的滋長。從化地區(qū)是亞熱帶地區(qū)，一年中大部分時間氣候濕熱，特別適合真菌等微生物滋長，有六十多萬人口，以農(nóng)業(yè)人口為主，城鎮(zhèn)周邊有眾多民工，人口聚集，極易發(fā)生淺表皮膚真菌的感染，到醫(yī)院皮膚科就診的患者大幅增多，因此急需快速有效的實驗室檢測方法[6-7]。

在淺表皮膚真菌病的診斷中，最為常用的方法是鈍刀刮取皮屑用10%KOH封片直接鏡檢，因為10%KOH的水溶液能夠溶解角質(zhì)細(xì)胞等雜質(zhì)而使真菌菌絲與孢子暴露出來，且能保持其自然的形態(tài)不被破壞，通過菌絲與孢子的折光性和因光線強(qiáng)弱調(diào)節(jié)顯現(xiàn)的暗綠色熒光即能進(jìn)行區(qū)分，此方法快速簡便，設(shè)備簡單，成本低，操作容易，是大小醫(yī)院均可開展的檢查項目[7-8]。但此方法真菌與背景對比較弱，且易于其他雜質(zhì)混淆，尤其在某些淺表皮膚真菌病中此缺點(diǎn)尤為明顯，如馬拉色菌毛囊炎，因此有必要探討不同淺表皮膚真菌病的最佳取材處理方式。

從表1的結(jié)果中可以得出不同的取材處理方式對不同淺表皮膚真菌病的直接鏡檢結(jié)果影響不一。對45例臨床擬診為花斑癬的患者同時用3種方法直接鏡檢后，得出的陽性率都較高，且經(jīng)過χ2檢驗顯示3種方法之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這可能與花斑癬患者的菌絲及孢子量有關(guān)，因為花斑癬患者的病變部位菌絲與孢子量非常多，皮損取材比較容易，且極易觀察到菌絲，因此漏檢率極低。但是對于診斷花斑癬來說，3種方法也有其優(yōu)缺點(diǎn)。鈍刀刮取10%KOH封片法直接鏡檢，鏡下可觀察到大量短小桿狀的菌絲及散在的孢子，真菌原有的形態(tài)被破壞，菌絲結(jié)構(gòu)不完整，孢子原始的聚集狀態(tài)也被破壞，而透明膠布粘貼法10%KOH濕片直接鏡檢則保留了真菌附著于皮膚時的自然形態(tài)，可觀察到完整形態(tài)的菌絲及葡萄串狀聚集的孢子，而鈍刀刮取革蘭染色法直接鏡檢的陽性率雖然是最高的，但是由于其耗時相對于其他兩種方法來說較長，且工序相對來說也比較繁瑣，所以在3種方法比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)的情況下，鈍刀刮取10%KOH封片法直接鏡檢及透明膠布粘貼法10%KOH濕片直接鏡檢是首選的方法。但是鈍刀刮取皮屑對于比較好控制的患者或者比較合作的患者來說較易進(jìn)行，而對于年齡較小的嬰幼兒，為消除其恐懼感進(jìn)而配合檢查，則建議使用透明膠布粘貼皮屑進(jìn)行取材[8-9]。

對52例臨床擬診為馬拉色菌毛囊炎的患者同時使用3種方法直接鏡檢后，鈍刀刮取10%KOH封片法直接鏡檢與透明膠布粘貼法10%KOH濕片直接鏡檢陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而鈍刀刮取革蘭染色法直接鏡檢的陽性率是最高的，且與另兩種方法的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這可能與馬拉色菌毛囊炎的病原性菌種有關(guān)，其屬于孢子菌屬，在病變部位一般以孢子的形式存在，且發(fā)病的人群都有一個特點(diǎn)，即是皮膚油脂特別多。因此用鈍刀刮取的皮屑可能混有血液、脂肪滴、組織液等雜質(zhì)，特別是脂肪滴，因其也有折光性，用10%KOH溶液濕片直接鏡檢的話與孢子極難區(qū)分，容易漏診、誤診，而經(jīng)過革蘭染色后的標(biāo)本，因為孢子被染成紅色，而其他如脂肪滴、角質(zhì)細(xì)胞等雜質(zhì)均不著色，且有一部分附著力極弱的雜質(zhì)被沖洗掉，背景比較干凈，對比鮮明，因而極易區(qū)分，得出的結(jié)果準(zhǔn)確性、可信度都較高。因此對于馬拉色菌毛囊炎此類淺表皮膚病來說，鈍刀刮取革蘭染色法直接鏡檢是首選方法[9-10]。

對64例臨床擬診為體表皮膚癬病的患者同時使用3種方法直接鏡檢后，3種方法兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且陽性率從高到低依次為鈍刀刮取10%KOH封片法直接鏡檢、透明膠布粘貼法10%KOH濕片直接鏡檢、鈍刀刮取革蘭染色法直接鏡檢。體表皮膚癬病的患者，病變部位會出現(xiàn)紅腫瘙癢、鱗屑，嚴(yán)重者會出現(xiàn)潰爛，且皮膚角質(zhì)化程度較高，皮屑也較多，但菌絲及孢子量相對較少。透明膠帶粘貼法雖然能夠保持真菌的原有形態(tài)，但同時也使得粘貼的皮屑處于一種聚集狀態(tài)，這對于皮屑較多真菌量較少的皮損檢查極為不利，因為膠帶粘貼的皮屑聚集在一塊很有可能把菌絲及孢子覆蓋住，且因皮膚角質(zhì)化程度高，10%KOH水溶液病不能完全把角質(zhì)細(xì)胞溶解，所以隱藏在皮屑中的菌絲及孢子并未暴露出來，極易造成漏診。而鈍刀刮取皮屑經(jīng)革蘭染色后直接鏡檢陽性率最低，可能是因為菌絲及孢子量少，且在革蘭染色時，因沖洗染液而把菌絲及孢子沖走造成假陰性而使陽性率變低。綜上，在體表皮膚癬病的檢查中，鈍刀刮取10%KOH封片法直接鏡檢是首選方法，但也要因人而異，對于皮膚潰爛或者皮膚稚嫩的患者，為減少患者的痛苦，建議選取透明膠帶粘取皮屑，而對于用藥過度不能完全清洗干凈的皮損部位建議用鈍刀刮取皮屑經(jīng)革蘭染色后直接鏡檢，因為經(jīng)革蘭染色后，菌絲與孢子均著色，而包括藥物等雜物也會被沖洗去部分，真菌與背景對比鮮明，相對另兩種方法來說較易觀察到[11-12]。

4 結(jié) 論

綜上所述，不同的取材處理方法對不同的淺表皮膚真菌病直接鏡檢結(jié)果的檢出率不同，應(yīng)該針對患者的實際情況選擇最佳的取材處理方式，在更好地服務(wù)于患者的同時，極大提高檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度，為臨床診斷和治療作出肯定依據(jù)，高效快速地作出診斷報告。