CXCL1在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)及其對Ishikawa細(xì)胞增殖侵襲的影響

孟潔, 李紅雨, 趙書君, 石鴻玉, 付晗

(鄭州大學(xué) 第三附屬醫(yī)院 婦科腫瘤病區(qū)， 河南 鄭州 450000)

子宮內(nèi)膜癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1].子宮內(nèi)膜樣腺癌是子宮內(nèi)膜癌中發(fā)病率最高的一種類型,預(yù)后較好，但仍有部分晚期患者的手術(shù)、內(nèi)分泌、放化療等治療效果欠佳，亟待尋找新的治療靶點(diǎn)[2].趨化因子配體1[chemokine (C-X-C motif) ligand 1，CXCL1]，也稱為生長調(diào)節(jié)因子α，是一種分泌型生長因子，在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，有研究發(fā)現(xiàn)CXCL1能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲，還能夠趨化腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞參與構(gòu)建腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[3].關(guān)于CXCL1在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)及作用機(jī)制，目前少有報(bào)道.本研究通過檢測子宮內(nèi)膜樣腺癌和子宮內(nèi)膜非典型增生患者的子宮內(nèi)膜組織及正常增生期子宮內(nèi)膜組織中CXCL1的表達(dá)，并從細(xì)胞水平驗(yàn)證其功能，探討CXCL1與子宮內(nèi)膜樣腺癌增殖侵襲的相關(guān)性，期望為腫瘤靶向治療提供一個(gè)可能思路[4].

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本

2016年9月至2018年12月于我院行手術(shù)治療經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為子宮內(nèi)膜樣腺癌患者的子宮內(nèi)膜組織，一部分(50例)福爾馬林固定，一部分(30例)-80 ℃保存，同時(shí)于手術(shù)標(biāo)本取出10 min內(nèi)收集距腫瘤邊緣2 cm范圍外的體積為3 mm×3 mm×3 mm的內(nèi)膜組織(病理證實(shí)為正常子宮內(nèi)膜組織)作為對照，放置-80 ℃保存，后續(xù)用于QRT-PCR檢測.同期借閱我院病理科診斷為子宮內(nèi)膜非典型增生患者的子宮內(nèi)膜組織及正常增生期子宮內(nèi)膜組織的石蠟包埋標(biāo)本，各40例.入選人群已排除應(yīng)用激素類藥物、合并有自身免疫性疾病、其他惡性腫瘤者、或經(jīng)放化療者.該實(shí)驗(yàn)已通過我院倫理委員會(huì)，并與患者簽署書面或口頭知情同意書.

1.1.2 細(xì)胞

人子宮內(nèi)膜高分化腺癌細(xì)胞株Ishikawa細(xì)胞購自中科院協(xié)和細(xì)胞庫.

1.1.3 主要試劑及器材

高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自以色列BI公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁公司，AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購及基質(zhì)膠均購自美國BD公司，transwell小室購自美國Corning公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR熒光定量檢測試劑盒購自日本TOYOBO公司，QRT-PCR引物購自北京擎科有限公司，兔抗人多克隆抗體CXCL1、兔抗人單克隆抗體MMP9及Caspase-3、CXCL1 ELISA試劑盒購自武漢三鷹集團(tuán)，兔抗人單克隆抗體pNF-κB p65及β-actin購自美國Cell Signaling Technology公司，DAB免疫組化試劑盒購自北京康為世紀(jì)有限公司，CXCL1干擾siRNA購自上海吉瑪有限公司，轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine3000及BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific集團(tuán).倒置熒光顯微鏡IX71(IX2-1LL100)購自奧林巴斯醫(yī)療株式會(huì)社，雙色紅外激光掃描成像系統(tǒng)(Odyssey CIX)購自美國LI-CORinc公司，酶標(biāo)儀(Thermo-MK3)購自美國ThermoFisher公司.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

Ishikawa細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(以下簡稱“完全培養(yǎng)基”)，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中，當(dāng)融合度達(dá)70%～90%時(shí)，進(jìn)行胰蛋白酶消化傳代或者計(jì)數(shù)鋪板.

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色法(IHC)檢測CXCL1蛋白的表達(dá)

組織固定及石蠟包埋切片，依次脫蠟，滅活內(nèi)源性酶，熱修復(fù)抗原，血清封閉，一抗(V一抗∶V抗體稀釋液=1∶200)孵育，4 ℃過夜，洗滌，二抗孵育30 min后進(jìn)行DAB染色，復(fù)染，封片，顯微鏡下觀察.CXCL1主要定位于胞漿，少數(shù)胞膜可見.結(jié)果采用半定量積分法判定：隨機(jī)選取5個(gè)400倍高倍視野，在每個(gè)高倍視野下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞(胞膜染色或胞膜、胞漿同時(shí)染色為陽性細(xì)胞)，無著色記錄為0分，淡黃色記錄為1分，棕黃色記錄為2分，棕褐色記錄為3分，記錄5個(gè)視野的平均數(shù)：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分；51%～75%為3分，>75%為4分，染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比得分乘積小于4為陰性，≥4為陽性.由兩位高年資病理醫(yī)師通過獨(dú)立雙盲法讀片評定免疫組化結(jié)果.

1.2.3 QRT-PCR法檢測組織及細(xì)胞中CXCL1mRNA的表達(dá)

提取RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用SYBR預(yù)混式熒光定量試劑盒，總反應(yīng)體系為20 μL,模板cDNA質(zhì)量濃度為0.5 ng/μL. CXCL1引物序列為Forward：5′-CCCAAACCGAAGTCATAGCC-3′，Reverse：5′-ATC-CGCCAGCCTCTATCACA-3′；內(nèi)參GAPDH序列為Forward: 5′-AGAACGGGAAGCTT-GTCATC-3′，Reverse:5′-CATCGCCCCACTTGATT-TTG-3′. 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性15 s，65℃退火15 s，72 °C延伸45 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán).系統(tǒng)自動(dòng)檢測熒光，得出Ct值(循環(huán)閾值).運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算CXCL1的表達(dá)情況.

1.2.4 siRNA技術(shù)干擾細(xì)胞CXCL1基因的表達(dá)

按照lipofectamine3000說明書操作.用熒光標(biāo)記的陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，在熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染效率.轉(zhuǎn)染效率大于70%后，分別轉(zhuǎn)染三條陽性siRNA，即siCXCL1-249,siCXCL1-322和siCXCL1-376.48 h后使用QRT-PCR檢測CXCL1的mRNA表達(dá)，72 h后ELISA法檢測上清液中CXCL1的蛋白表達(dá)，選擇干擾效率最佳的一條siRNA進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn).

1.2.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

將細(xì)胞按照5×103/孔的密度接種于96孔板中，加入100 μL培養(yǎng)液，24 h后，CXCL1沉默組轉(zhuǎn)染干擾效率最佳的siRNA,NC(normal control)組轉(zhuǎn)染陰性對照RNA，于轉(zhuǎn)染后0、48、72 h加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱放置1.5 h，檢測450 nm處的光密度.

1.2.6 流式細(xì)胞儀Annexin Ⅴ-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡率

將細(xì)胞按照1×105/孔接的密度種于6孔板上，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，CXCL1沉默組轉(zhuǎn)染篩選的干擾效率最佳的siRNA，NC組轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA，培養(yǎng)48 h后，用不含EDTA的胰酶消化，收集細(xì)胞，以1 000 r/min離心5 min，PBS清洗細(xì)胞2 次，收集(1～5)×105個(gè)細(xì)胞加入binding buffer體積400 μL置冰浴,每管內(nèi)加入FITC-Ⅴ體積5 μL，于流式細(xì)胞儀檢測前加入PI體積5 μL，binding buffer體積100 μL混勻，避光孵育15 min，加入PI后1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測.

1.2.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

將細(xì)胞按照3×105/孔的密度接種于6孔板中，加入完全培養(yǎng)基2 mL,24 h后，CXCL1沉默組轉(zhuǎn)染干擾效率最佳的siRNA,NC組轉(zhuǎn)染陰性對照RNA，轉(zhuǎn)染6 h后用10 μL槍頭參照直尺在6孔板底部劃線，間隔1 cm劃兩條直線，再垂直它們劃兩條間隔1 cm的直線，PBS沖洗3次，加入無血清培養(yǎng)基，分別于0、48、72 h拍照記錄.劃痕寬度代表細(xì)胞的遷移能力，通過Image J劃線法測量，細(xì)胞的遷移能力用遷移率表示.遷移率=(0 h間隙寬度-觀察時(shí)間點(diǎn)間隙寬度)/0 h間隙寬度.

1.2.8 transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力

用Matrigel膠1∶4稀釋后取50 μL置于transwell小室上室，37 ℃放置5 h，吸棄多余液體，加入100 μL無血清培養(yǎng)基水化基質(zhì)膠，37 ℃，30 min后吸棄培養(yǎng)液.收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，PBS清洗3次，無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，吸取200 μL細(xì)胞混懸液置于上室，下室內(nèi)加入600 μL體積分?jǐn)?shù)為20%胎牛血清的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)72 h后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛，固定30 min，清洗后4 ℃風(fēng)干，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察，取6個(gè)視野平均細(xì)胞數(shù)，代表腫瘤細(xì)胞的侵襲能力.

1.2.9 Western Blot檢測蛋白表達(dá)

將細(xì)胞按照1×105/孔接種于6孔板上，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，CXCL1沉默組轉(zhuǎn)染篩選的干擾效率最佳的siRNA，NC組轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，棄去原培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞1次，胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞基本脫落時(shí)加入足量完全培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞至10 mL離心管，1 500 r/min離心10 min，棄上清，用預(yù)冷PBS清洗一次，加RIPA裂解液于冰上裂解30 min，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，于4 ℃，12 000 r/min離心30 min，收集上清液，用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白質(zhì)量濃度，按比例(V蛋白溶液體積∶V上樣緩沖液體積=1∶4)加入上樣緩沖液，于100 ℃沸水中變性10 min，每組上樣蛋白質(zhì)量為40 μg，行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS-PAGE電泳分離目的蛋白，冰浴條件下300 mA恒流1 h轉(zhuǎn)至PVDF膜，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂牛奶于室溫封閉1.5 h，TBST洗滌4次，每次5 min，稀釋后的一抗(V一抗∶V抗體稀釋液=1∶1 500)孵育，4 ℃過夜，TBST洗滌4次，每次5 min，稀釋后的二抗(V二抗∶V抗體稀釋液=1∶1 500)孵育1 h，TBST洗滌4次，每次5 min，Immobilion Western HRP底物發(fā)光液暗室顯像，Image J軟件分析條帶灰度值，取目的條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值為目的蛋白的相對表達(dá)量.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同子宮內(nèi)膜組織中CXCL1的表達(dá)情況

CXCL1定位于胞漿內(nèi)，正常增生期子宮內(nèi)膜組織，非典型增生子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜樣腺癌組織的陽性率分別為40.0%， 62.5%，76.0%，子宮內(nèi)膜樣腺癌組織陽性率與非典型增生子宮內(nèi)膜組織之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但均顯著高于正常增生期組織(P<0.05)，免疫組化圖像見圖1，CXCL1在各組織中的表達(dá)情況見表1.在不同年齡、是否絕經(jīng)、不同分化程度及不同浸潤深度的患者中，CXCL1的表達(dá)無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而在腫瘤直徑較大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期較晚的患者中，CXCL1的表達(dá)顯著升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，表2).

A:正常增生期子宮內(nèi)膜組織；B:非典型增生子宮內(nèi)膜組織；C:子宮內(nèi)膜樣腺癌組織.

表1 不同組織類型中CXCL1免疫組化結(jié)果的陽性率

Table 1 Positive expression rate of CXCL1 in different kind of tissues measured by immunohistochemistry assay

組別nn陽性(%)n陰性(%)正常增生期子宮內(nèi)膜組織4016(40.0)24(60.0)非典型增生子宮內(nèi)膜組織4025(62.5)15(37.5)1)子宮內(nèi)膜樣腺癌組織5038(76.0)1)12(24.0)

1)與正常子宮內(nèi)膜組織比較，P<0.05.

1)Compared with proliferative endometrial tissues，P<0.05.

表2 CXCL1表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣腺癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

Table 2 Correlation between CXCL1 expression and clinicopathological parameters of endometrioid adenocarcinoma

臨床病理參數(shù)n高表達(dá)n低表達(dá)2值P值年齡/歲0.1190.730 ≤50185 >50207絕經(jīng)0.6750.411 是215 否177分化程度1.5220.467 高分化287 中分化43 低分化62浸潤深度1.1450.285 <1/22711 ≥1/2111腫瘤直徑5.2460.036 <6 cm2111 ≥6 cm171淋巴轉(zhuǎn)移5.6450.018 有151 無13分期6.9480.008 Ⅰ-Ⅱ期2011 Ⅲ-Ⅳ期181

共有20名患者進(jìn)行淋巴結(jié)清掃術(shù)(術(shù)前大部分患者已行內(nèi)膜診刮，對于淋巴結(jié)的清掃，結(jié)合術(shù)中剖開暴露宮腔明確腫瘤直徑以及術(shù)前MRI決定，所選入組患者均未行術(shù)前放化療).

A total of 20 patients underwent lymph node dissection (most patients had undergone endometrial scraping before surgery, for lymph node dissection, combined with intraoperative exposure of the uterine cavity to determine the tumor diameter and preoperative MRI decision, none of the selected patients were enrolled preoperative radiotherapy and chemotherapy).

2.2 CXCL1在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中的表達(dá)

在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織與癌旁組織中的CXCL1mRNA表達(dá)水平分別為：(3.35±1.85)，(1.76±1.86),CXCL1在癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.034，P=0.002)，見圖2.

1)與癌旁組織比較，P<0.01.

1)Compared with adjacent tissues,P<0.01.

圖2 子宮內(nèi)膜樣腺癌與癌旁組織中CXCL1的相對表達(dá)

Fig.2CXCL1mRNA expression in endometrioid adenocarcinoma tissues and adjacent tissues

2.3 干擾效率最佳siRNA的選擇

優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，使轉(zhuǎn)染效率大于70%，轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的熒光圖像見圖3.轉(zhuǎn)染后48 h，經(jīng)QRT-PCR法檢測，NC組、siCXCL1-249組、siCXCL1-322組、siCXCL1-376組CXCL1mRNA的相對表達(dá)量分別為(1.21±0.65)，(0.09±0.03)，(0.19±0.18)，(0.05±0.04).與NC組比較，其余3組CXCL1mRNA的表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)，但3組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).轉(zhuǎn)染后72 h，NC組、siCXCL1-249組、siCXCL1-322組、siCXCL1-376組細(xì)胞上清液中CXCL1的蛋白質(zhì)量濃度分別為(96.00±15.75)pg/mL，(37.80±12.07)pg/mL，(62.20±9.26)pg/mL，(25.2±5.26)pg/mL.與NC組比較，其余3組CXCL1的蛋白質(zhì)量濃度均顯著降低(P<0.05)；siCXCL1-376組與其他3組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖4).故選取siCXCL1-376作為干擾siRNA沉默CXCL1基因表達(dá)，進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn).

2.4 沉默CXCL1后Ishikawa細(xì)胞增殖情況

與NC組比較，轉(zhuǎn)染24 h后，CXCL1沉默組的細(xì)胞增殖無統(tǒng)計(jì)學(xué)變化，轉(zhuǎn)染48、72、96 h后，CXCL1沉默組的細(xì)胞增殖明顯受到抑制(P<0.05，P<0.01)，且隨著時(shí)間延長，抑制作用更加明顯(圖5).

圖3 普通光學(xué)顯微鏡及熒光顯微鏡下siRNA轉(zhuǎn)染情況(×400)

1)與NC組比較，P<0.05；2)與siCXCL1-249組比較，P<0.05；3)與siCXCL1-322組比較，P<0.05.1)Compared with NC group，P<0.05；2)Compared with siCXCL1-249 group，P<0.05；3)Compared with siCXCL1-322 group，P<0.05.

1)與NC組比較，P<0.05；2)與NC組比較，P<0.01.

1)Compared with NC group，P<0.05；2)Compared with NC group，P<0.01.

圖5 沉默CXCL1后細(xì)胞增殖情況

Fig.5 Proliferation of Ishikawa cells withCXCL1knockdown

2.5 沉默CXCL1后Ishikawa細(xì)胞凋亡情況

轉(zhuǎn)染72 h后，NC組與CXCL1沉默組的凋亡率分別為(6.3±0.3)%，(8.7±0.7)%，與NC組比較，CXCL1沉默組的凋亡率顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.012<0.05，圖6).流式細(xì)胞儀檢測的凋亡率數(shù)值較低，故加測凋亡蛋白Caspase-3蛋白表達(dá)以進(jìn)一步驗(yàn)證. NC組與CXCL1沉默組Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量分別為(0.34±0.02),(0.64±0.11)，與NC組比較，CXCL1沉默組的Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，見圖7.

2.6 沉默CXCL1后Ishikawa細(xì)胞遷移能力變化

與NC組比較，轉(zhuǎn)染48 h后，CXCL1沉默組的細(xì)胞遷移率無統(tǒng)計(jì)學(xué)變化，轉(zhuǎn)染72 h后，CXCL1沉默組的細(xì)胞遷移率顯著降低(P<0.05，圖8).

1)與NC組比較，P<0.05.
1)Compared with NC group，P<0.05.

圖6 沉默CXCL1后Ishikawa細(xì)胞凋亡情況

Fig.6 Apoptosis of Ishikawa cells withCXCL1knockdown

圖7 沉默CXCL1后Ishikawa細(xì)胞Caspase-3蛋白的表達(dá)情況

Fig.7 Expression of Caspase-3 protein in Ishikawa cells withCXCL1knockdown

2.7 沉默CXCL1后Ishikawa細(xì)胞侵襲能力變化

NC組與CXCL1沉默組細(xì)胞平均穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(95.33±13.01)，(24.33±6.66)，與NC組比較，CXCL1沉默組穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.004<0.05，圖9).

2.8 沉默CXCL1后 Ishikawa細(xì)胞pNF-κB及MMP9蛋白的表達(dá)

NC組與CXCL1沉默組NF-κB p65蛋白的相對表達(dá)量分別為(0.85±0.15)，(0.81±0.13)，pNF-κB p65蛋白的相對表達(dá)量分別為(0.69±0.13)，(0.32±0.08)，NF-κB p65蛋白的磷酸化率分別為(81.25±15.56)%，(40.61±12.52)%，與NC組比較，CXCL1沉默組NF-κB p65蛋白的磷酸化率顯著降低(P<0.05)；兩組MMP-9的相對蛋白表達(dá)量分別為(0.64±0.08)，(0.17±0.07)，與NC組比較，CXCL1沉默組MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05).見圖10.

圖8 沉默CXCL1后Ishikawa細(xì)胞遷移情況(×400)

Fig.8 Migration of Ishikawa cells withCXCL1knockdown(×400)

1)與NC組比較，P<0.05.1)Compared with NC group，P<0.05.

圖10 沉默CXCL1后Ishikawa細(xì)胞pNF-κB及MMP9蛋白的表達(dá)情況

Fig.10 Expression of pNF-κB and MMP9 protein in Ishikawa cells withCXCL1knockdown

3 討論

子宮內(nèi)膜樣腺癌是子宮內(nèi)膜癌中發(fā)病率最高的一種類型，預(yù)后較好，但仍有一部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)疾病已到晚期，故需要更有效的新的治療手段.有研究顯示趨化因子及相關(guān)信號(hào)通路的激活與腫瘤的進(jìn)展轉(zhuǎn)移有關(guān)，而子宮內(nèi)膜樣腺癌的預(yù)后與某些特定趨化因子關(guān)系密切，已有研究顯示趨化因子配體12[chemokine (C-X-C motif) ligand 12，CXCL12]，白介素8(interleukin-8，IL-8)， 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)等趨化因子及相應(yīng)受體在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中高表達(dá)，對其發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用[5-7]，可能成為治療子宮內(nèi)膜樣腺癌的新靶點(diǎn).因此探究趨化因子與子宮內(nèi)膜樣腺癌的關(guān)系也可能為腫瘤靶向治療提供依據(jù).

CXCL1是趨化因子家族中的一員，可通過自分泌與旁分泌模式調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖凋亡及轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路，亦可以通過募集白細(xì)胞和激活促炎介質(zhì)塑造腫瘤微環(huán)境而促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[8].Kuo[9]的研究小組報(bào)道，CXCL1可激活前列腺癌中的NF-κB/HDAC1(nuclear factor kappa-B/histone deacetylase 1)信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖；有學(xué)者[10]進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重組人抗CXCL1抗體可減少白介素6(Interleukin-6，IL-6)及金屬蛋白酶MMPs(matrix metalloproteinase)的產(chǎn)生，增加金屬蛋白酶組織抑制因子4[tissue inhibitor of metalloproteinases4(TIMP-4)]的產(chǎn)生進(jìn)而抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲；Korivi過表達(dá)CXCL1后發(fā)現(xiàn)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activited protein kinase，MAPK)途徑被激活，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)產(chǎn)物增加，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲[11].大量關(guān)于卵巢癌[12]及乳腺癌[13]的研究表明，CXCL1通過與多種腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞表面均會(huì)表達(dá)的CXCR2(C-X-C chemokine receptor type 2)受體結(jié)合，可增加髓源性巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生及募集，穩(wěn)固腫瘤微環(huán)境，加強(qiáng)免疫抑制[14]，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展.

然而關(guān)于CXCL1與子宮內(nèi)膜樣腺癌相關(guān)性的研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中CXCL1表達(dá)顯著升高，不同病理分級(jí)的子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中CXCL1表達(dá)差異不明顯，腫瘤直徑較大、有淋巴轉(zhuǎn)移、分期較晚患者的子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中CXCL1表達(dá)量顯著升高，提示其可能成為子宮內(nèi)膜樣腺癌的一種潛在的腫瘤標(biāo)志物.體外實(shí)驗(yàn)中，沉默CXCL1后，細(xì)胞增殖明顯被抑制，細(xì)胞凋亡率及凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)量均增加，細(xì)胞遷移及侵襲能力均降低.

NF-κB是在生物體內(nèi)普遍存在并穩(wěn)定表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄因子，可因各種致癌物質(zhì)、生長因子等的刺激發(fā)生磷酸化、泛素化而被激活，從而發(fā)揮生物學(xué)作用，在包括子宮內(nèi)膜樣腺癌在內(nèi)的多種類型腫瘤中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖凋亡、血管形成及轉(zhuǎn)移[15].本研究發(fā)現(xiàn)，沉默CXCL1后，磷酸化的NF-κB蛋白表達(dá)量減少，而EMT促轉(zhuǎn)移相關(guān)物質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9蛋白表達(dá)量也減少，MMP-9被證明多為NF-κB依賴型，在NF-κB調(diào)控下，發(fā)揮增加血管形成、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移等作用[16-17].本研究提示沉默CXCL1可能下調(diào)磷酸化NF-κB進(jìn)而抑制Ishikawa細(xì)胞的增殖、遷移能力及侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對腫瘤的抑制作用.而有學(xué)者在結(jié)腸癌的相關(guān)報(bào)道中提出CXCL1基因近端啟動(dòng)子有NF-κB反應(yīng)元件，CXCL1可能依賴NF-κB的活化而被激活表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長[18]，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)，猜想CXCL1與NF-κB可能存在一種反饋調(diào)節(jié)，共同促進(jìn)腫瘤的增殖侵襲，這需要進(jìn)一步驗(yàn)證.

總而言之，結(jié)合免疫組化和組織QRT-PCR結(jié)果以及體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明CXCL1在子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中表達(dá)升高，沉默CXCL1可以降低Ishikawa細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，CXCL1可能通過NF-κB磷酸化發(fā)揮促腫瘤進(jìn)展的作用.后續(xù)可予以不同類型的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株來明確CXCL1在其他類型子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)，后期本課題組也將以腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞為出發(fā)點(diǎn)尋找其相關(guān)性.腫瘤發(fā)生紛繁復(fù)雜，多種蛋白通路交錯(cuò)構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，CXCL1與子宮內(nèi)膜樣腺癌發(fā)生發(fā)展可能有更多的機(jī)制需要去探索.結(jié)合CXCL1對腫瘤自身增殖侵襲作用的抑制，也為腫瘤的靶向治療提供了一個(gè)可能，然而其能否用于臨床，仍需后續(xù)大量實(shí)驗(yàn)以及臨床大數(shù)據(jù)研究.