耕作措施對隴中麥豆輪作系統(tǒng)土壤真菌群落的影響

沈吉成，李玲玲，謝軍紅，彭正凱，Eunice Essel，鄧超超，王進斌，頡健輝

（甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室/甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，80%～90%的土壤相關(guān)功能都被微生物所調(diào)節(jié)，包括土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，系統(tǒng)的穩(wěn)定性及抗干擾能力等［1］。其中真菌構(gòu)成了土壤的大部分微生物生物量，其具有分解有機質(zhì)、為植物提供養(yǎng)分的功能，是生態(tài)系統(tǒng)健康的指示物［2］。近年來對不同耕作措施下土壤微生物生物量及微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究越來越受到人們的重視。研究表明，保護性耕作有利于提高土壤微生物活性和數(shù)量，少免耕結(jié)合作物秸稈覆蓋，可以提高土壤表層微生物量及種群多樣性［3］，與傳統(tǒng)耕作相比，免耕可以改善真菌群落結(jié)構(gòu)組成與多樣性［4］。隴中旱農(nóng)區(qū)由于傳統(tǒng)耕作方式以翻耕為主，導(dǎo)致該地區(qū)水土流失嚴(yán)重，土壤結(jié)構(gòu)破壞，肥力低下，而保護性耕作措施具有改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤質(zhì)量的作用，尤其以免耕秸稈覆蓋作用最顯著［5］。然而，關(guān)于長期不同耕作措施對隴中旱農(nóng)區(qū)土壤性狀的影響，以往研究主要集中在土壤肥力［5］、有機碳［6］、團聚體［7］等方面，但對土壤真菌群落構(gòu)成和多樣性的影響缺乏研究。因此，為了理解土壤真菌對耕作措施與秸稈覆蓋的響應(yīng)，全面認(rèn)識耕作措施對黃綿土土壤中真菌群落構(gòu)成、物種豐度、物種多樣性的影響，本研究應(yīng)用高通量測序方法探究不同耕作措施下土壤真菌群落組成與結(jié)構(gòu)的差異，以期為保護性耕作的推廣應(yīng)用提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 研究地區(qū)與方法

1.1 試區(qū)概況

本研究于2018 年在位于甘肅省定西市李家堡鎮(zhèn)的甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)旱作農(nóng)業(yè)綜合實驗站進行，所依托田間定位試驗始于2001 年。該區(qū)屬中溫帶半干旱偏旱區(qū)，太陽輻射量為592.9kJ·cm-2，多年平均日照時數(shù)2477h；年均氣溫6.4℃，≥0℃積溫為2934℃，≥10℃積溫為2239℃，年均無霜期140d；多年平均降水量391mm，年蒸發(fā)量1531mm，為典型的一年一熟雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)。試區(qū)土壤為典型黃綿土，土層深厚，土質(zhì)較綿軟，質(zhì)地較均勻，貯水性能良好。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用春小麥和豌豆雙序列輪作方式（豌豆-小麥、小麥-豌豆）。各序列分別設(shè)4個處理（表1），3 次重復(fù)，小區(qū)面積80m2（4m×20m），隨機區(qū)組排列。

表1 試驗處理及代碼描述

春小麥播量187.5kg·hm-2；豌 播量100kg·hm-2。小麥行距20cm，豌豆行距24cm，播深均為7cm。春小麥播期為每年3月中旬，7 月下旬至8 月上旬期間收獲；豌豆于4月上旬播種，7月中下旬收獲。小麥各處理均施氮105kg·hm-2，P2O5105kg·hm-2；豌豆各處理均施氮20kg·hm-2，P2O5105kg·hm-2，播種時作基肥混施。試驗春小麥品種為“定西40 號”，豌豆品種為“綠農(nóng)2 號”。

1.3 樣品采集與分析

土壤樣品采集于2018 年6 月豌豆田非根際土，對角線五點法采集每個小區(qū)0～10、10～30cm土樣，分層混勻后除去根系等雜物，各小區(qū)各層次土樣（共24 個土樣）在田間立刻存入干冰箱，帶回實驗室-80℃保存，用于分析土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。

土壤微生物DNA 提取采用美國（MOBIO Power Soil DNA Isolation Kit）強力土壤DNA 提取試劑盒。按照試劑盒說明書進行。用0.7%瓊脂糖凝膠電泳對土壤DNA 的完整性進行檢測。

真菌引物ITS3F（5′-GCATCGATGAAGAAC GCAGC-3′）和ITS4（55′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′）擴增ITS2 片段。PCR反應(yīng)程序為：95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃1min 共35個循環(huán)；72℃7min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂凝膠電泳檢測，所得產(chǎn)物經(jīng)PCR 產(chǎn)物純化試劑盒進行回收、測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用數(shù)據(jù)庫FLASH、QIIME、UNITE和INSDC分析土壤中真菌物種多樣性，對優(yōu)質(zhì)序列在相似性≥97%的水平上進行OTU（Operation taxonomic unit）聚類。采用QIIME和Mothur 軟件［8-9］計算真菌群落豐度指數(shù)（Observed species指數(shù)和Chao指數(shù)）和多樣性指數(shù)（香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)），測序深度用Good-coverage指數(shù)表示；應(yīng)用R 軟件對OTU 豐度進行主成分分析（PCA）并制圖，利用SPSS19 進行方差分析。土壤微生物總DNA 的提取、測序委托南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 耕作措施對門分類水平上土壤真菌群落分布比例的影響

4 種耕作模式下門水平上真菌群落結(jié)構(gòu)（圖1），豐度大于1%的真菌門類中優(yōu)勢菌群為子囊菌門（Ascomycota）約52.74%，擔(dān)子菌門（Basidiomycota）約14.10%。保護性耕作措施（NTS、NT、TS）能不同程度增加子囊菌門、擔(dān)子菌門所占真菌群落百分比。其中0～30cm 土層，較T處理，NTS 處理擔(dān)子菌門增加15.01%，NT 處理擔(dān)子菌門增加1.86%，子囊菌門增加3.67%，TS 處理分別增加2.42%和4.35%，表明土壤真菌群落變化因不同的耕作方式有明顯變化。

2.2 不同耕作模式下土壤真菌群落的豐富度和多樣性

Chao 指 數(shù) 和Observed species指數(shù)可估計群落中實際存在的物種數(shù)，一般而言，Chao 指數(shù)或Observed species 指數(shù)越大，群落的豐富度越高；香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)可反映群落物種多樣性，香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)越大，說明群落多樣性越高。不同耕作措施對0～30cm 土層土壤真菌群落豐富度與多樣性的影響如表2 所示，樣本測序深度指數(shù)值均在99%以上，由表2 可知各處理間差異不顯著（P＞0.05）。其中0～10cm土層NT 處理土壤真菌豐富度指數(shù)（Chao 指數(shù)、Observed species指數(shù)）最高，10～30cm 土層NTS 處理豐富度指數(shù)最高。秸稈還田處理（NTS、TS）下土壤真菌多樣性指數(shù)（香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)）大于單純的免耕和傳統(tǒng)耕作。

圖1 門分類水平上土壤真菌群落分布比例

表2 不同耕作措施下0～30cm 土層土壤真菌豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)

2.3 不同耕作措施對土壤真菌OTU 豐度的影響

采用基于真菌群落在不同土層豐度的主成分分析方法，研究不同耕作模式下0～30cm土壤真菌群落豐度的具體差異。如圖2A 所示0～10cm 土層PC1 貢獻(xiàn)率為13.81%，PC2 的貢獻(xiàn)率為10.67%，較T 處理，NTS 處理真菌群落分布于PC1 的負(fù)值區(qū)域和PC2 的正負(fù)值區(qū)域，其分布較集中，NT 次之，且NTS、NT 處理下真菌群落距離近；10～30cm 土 層PC1 貢 獻(xiàn) 率 為12.46%，PC2 的 貢獻(xiàn) 率 為10.89%（圖2B），較T處理NT、NTS 處理真菌群落均分布于PC1 正值區(qū)域，NT＞NTS，且NTS、NT 處理下真菌群落距離近。因此保護性耕作對提高真菌群落豐度作用顯著，其中以免耕秸稈覆蓋效果最佳。

2.4 不同耕作措施對土壤真菌OTU 群落聚類的影響

如表3 所示，不同耕作措施對0～30cm 土層土壤真菌OTU 數(shù)量變化作用明顯。其中0～10cm土層NT 處理真菌OTU數(shù)量最多（442），10～30cm 土層NTS 處理最多（459）。結(jié)合OTU 韋恩圖（圖3）可知，0～10cm土層共同包含OTU 數(shù)量為2527，其中NT 處理OTU 數(shù)量最多為793 個，特有OTU 為106；10～30cm 土層共同包含OTU 數(shù)為2589，其中NTS處理OTU 最多為796 個，特有OTU 為123。0～30cm 土層較T處理，NTS 處 理OTU 數(shù)量提高8.07%，NT 處理提高12.41%。各處理真菌特有OTU 數(shù)量NT（115）＞NTS（104）＞TS（101）＞T（85），表明免耕、免耕秸稈覆蓋有利于增加土壤0～30cm 真菌類群。

圖2 不同耕作措施下0～30cm 土層土壤真菌OTU 主成分分析

表3 不同耕作措施下土壤樣本獲得的真菌OTU 序列讀數(shù)

圖3 不同耕作措施下0～30cm土層土壤真菌OTU 韋恩圖

3 討論與結(jié)論

從OTU 聚類韋恩圖中看出，0～30cm 土層較T 處理，NTS 處理OTU 數(shù)量提高8.07%，NT 提高12.41%。真菌特有OTU數(shù)量NT（115）＞NTS（104）＞TS（101）＞T（85）。相對于傳統(tǒng)耕作，保護性耕作措施不僅提高0～30cm 土壤真菌群落的豐度，且特有真菌類群也相對較高，尤以免耕秸稈覆蓋提高土壤真菌群落的豐度和類群最突出；同時子囊菌門、擔(dān)子菌門為隴中旱農(nóng)區(qū)麥豆輪作系統(tǒng)土壤真菌的主要優(yōu)勢種群，其中免耕秸稈覆蓋處理下?lián)泳T豐度較傳統(tǒng)耕作增加15.01%，免耕處理子囊菌門、擔(dān)子菌門豐度較傳統(tǒng)耕作分別提高3.67%、1.86%。這與程存剛等［10］觀點基本一致。其原因是免耕秸稈覆蓋改善土壤結(jié)構(gòu)，改變土壤微生物棲息地，為微生物的生長活動提供必要的能源和營養(yǎng)物質(zhì)，提高土壤中微生物的活性［11］，從而加快土壤中微生物的自身物質(zhì)合成，并利用外源養(yǎng)分進行新陳代謝。同時秸稈還田改善土壤物理性狀，有利于土壤有機碳、土壤微生物生物量碳的累積［12］，有利于提高土壤微生物豐度及活性。

多樣性指數(shù)是評價土壤微生物群落豐富度和多樣性的重要指標(biāo)，高的多樣性指數(shù)表明高的微生物群落豐富度和多樣性［13］。本研究結(jié)果表明，秸稈還田處理（NTS、TS）下土壤真菌豐富度和多樣性指數(shù)（Observed species指數(shù)、Chao指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)）均大于單純的免耕和傳統(tǒng)耕作，但各處理間差異不顯著（P＞0.05）。這與Souza 等［14］的研究結(jié)果不一致，這可能與耕作年限有關(guān)。由于免耕年限較短，對不同類型的微生物群落影響不同，不同微生物群落間，豐度增降相互抵消［15］，而在生長季節(jié)秸稈還田的影響被作物生長效應(yīng)對微生物群落的影響所掩蓋［16］，同時隨著秸稈還田量的增加，短期免耕影響被秸稈還田所掩蓋［17］，而短期的免耕增加了土壤擾動，增加土壤的通氣性［18］，導(dǎo)致秸稈覆蓋效應(yīng)被掩蓋。此外Xiang 等［19］和董煒靈等［20］指出不同時空尺度下氣候因子和土壤理化因子也會對土壤真菌群落多樣性結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響，保護性耕作措施對土壤真菌群落豐富度與多樣性的影響需進一步深入研究。因此在隴中旱農(nóng)區(qū)保護性耕作措施有利于提高土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。其中以免耕秸稈覆蓋對提高土壤真菌群落豐富度與多樣性作用最明顯。