五葉山小橘葉化學(xué)成分的研究

陳玉，年賀鳳，盧青秀，滕海達，杜艷

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，武漢 430074)

五葉山小橘(Glycosmispentaphylla)是蕓香科(Rutaceae)山小橘屬(Glycosmis)植物，為我國傳統(tǒng)傣藥，具有補土健胃、強身健體、除風(fēng)通血止痛等功效[1].在東南亞傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，也可以治療咳嗽、風(fēng)濕病、貧血、關(guān)節(jié)炎、黃疽等病癥，以及用于預(yù)防各種癌癥[2].現(xiàn)代藥理研究表明五葉山小橘的提取物具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗增殖、抗突變、殺蟲等生物活性[3].前期植物化學(xué)的研究表明，其主要的化學(xué)成分以生物堿、黃酮等結(jié)構(gòu)類型為主[4-6].本課題組致力于傣藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究[7]，前期研究了五葉山小橘莖的化學(xué)成分并從中分離得到的12個生物堿和18個非生物堿[8,9].為進一步擴大該植物的藥用部位，本文采用溶劑提取法，正、反相硅膠柱和半制備高效液相色譜法從該植物葉的乙醇提取物中分離得到10個化合物，包含4個木脂素、3個生物堿、2個甾體以及1個萜類化合物，其結(jié)構(gòu)分別鑒定為：山小橘新木脂烷甲素(1)、3,4-二-(4-羥基-3-甲基苯環(huán))四氫呋喃(2)、表松脂醇(3)、松脂醇(4)、3-吲哚甲醛(5)、香草木寧(6)、山小桔堿(7)、pregnenolone(8)、16-dehydropregnenolone (9)、lochmolin E(10).其中化合物1為新的4,7-環(huán)氧-8,3-新木脂烷類化合物，化合物2～4、8～10是首次從該植物中分離得到.

1 儀器與材料

高效液相色譜儀(Ultimate 3000 半制備型，美國戴安，VWD，DAD 檢測器)；色譜柱(半制備型，YMC-Pack ODS-A，250 mm × 10 mm，5 μm)；核磁共振波譜儀(AM-600/500型，德國Bruker)；電子天平(AX224ZH/ E型，常州奧豪斯儀器)；高分辨質(zhì)譜儀(Q Exactive，賽默飛世爾科技)；三用紫外分析儀(ZF-I型，上海顧村電光)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE2000A型，上海亞榮生化)；循環(huán)水式多用真空泵(SHB-111A型，上海貝菌科技)；柱色譜硅膠(80～100目，國藥集團)；柱色譜硅膠(200～300、300～400目，青島海洋化工)；反相硅膠(50 μm,YMC·GEL ODS-A-HG,AAG12S50)；硅膠板(GF 254型，青島海洋化工).

石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇(分析純，國藥集團)；95%工業(yè)乙醇、甲醇(色譜級，Sigma)；乙腈(色譜級，中國昌泰興業(yè))，HPLC洗脫溶劑：A=乙腈；B=甲醇；C=1‰甲酸水溶液.五葉山小橘葉采于云南西雙版納，經(jīng)云南西雙版納傣族自治州民族醫(yī)藥研究所趙應(yīng)紅主任藥師鑒定為蕓香科山小橘屬植物五葉山小橘Glycosmispentaphylla(Retz.)Correa 的葉.

2 提取與分離

取干燥五葉山小橘葉12 kg經(jīng)粉碎后用90%乙醇室溫浸提3次，每次24 h，提取液真空抽濾后減壓旋蒸得乙醇提取物(860 g).乙醇提取物用一定量的甲醇溶解后用等量的石油醚分三次萃取，得石油醚組分(100 g)和甲醇組分(740 g).甲醇組分經(jīng)過聚酰胺柱層析，采用水-乙醇為流動相梯度洗脫(1∶0,7∶3,5∶5,3∶7,0∶10)，TLC檢測合并得到5個組分(Fr.1～Fr.5).Fr.2(90 g)經(jīng)硅膠柱層析(200～300目)分離，二氯甲烷-甲醇(100∶1,20∶1,9∶1,8∶2)梯度洗脫以及TLC檢測后合并得到13個組分(Fr.2.1～Fr.2.13).Fr.2.5(9.27 g)經(jīng)50m反相硅膠柱分離，水-甲醇梯度洗脫(7∶3,1∶1,3∶7,0∶1)以及TLC檢測后合并得7個組分(Fr.2.5.1～Fr.2.5.7).Fr.2.5.1經(jīng)HPLC反復(fù)制備得到化合物1[2 mg,V(A)∶V(C)=39∶61,tR=23 min],2[3.9 mg,V(A)∶V(C)=36∶64,tR=23 min]，3[3.6 mg,V(A)∶V(C)=34∶66,tR=19 min],4[2.2 mg,V(B)∶V(C)=52∶48,tR=13 min],5[2 mg,V(A)∶V(C)=32∶68,tR=12 min],6[4.2 mg,V(A)∶V(C)=36∶64,tR=19 min],7[3 mg,V(A)∶V(C)=48∶52,tR=18 min],10[1.5 mg,V(A)∶V(C)=39∶61,tR=21 min].Fr.2.5.4(0.5 g)經(jīng)硅膠柱層析分離以及TLC檢測后合并得8個組分(Fr.2.5.4.1～Fr.2.5.4.8).Fr.2.5.4.2經(jīng)HPLC[流動相V(B)∶V(C)=52∶48,流速3 mL/min]分離得到化合物8(0.8 mg,tR=14 min)，9(2.4 mg,tR=15 min).化合物1～10的結(jié)構(gòu)式見圖1.

圖1 化合物1～10的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulas for compounds 1—10

3 結(jié)構(gòu)鑒定

圖2 化合物1的主要HMBC和ROESY相關(guān)Fig.2 Structure and key HMBC and ROESY correlations of compound 1

表1 化合物1的1H NMR和13C NMR 數(shù)據(jù)(600/150 MHz,CD3OD)Tab.1 1H NMR and 13C NMR data of compound 1

化合物2:白色粉末，分子式為C20H24O5.1H NMR(600 MHz,CD3OD)δH:6.68(2H,d,J=7.8 Hz,H-5,H-5′),6.54(2H,dd,J=1.8,8.4 Hz,H-6,H-6′),6.60(2H,d,J=1.2 Hz,H-2,H-2′),3.80(2H,dd,J=6.6,8.4 Hz,H-9a,H-9a′),3.79(6H,s,OCH3-3,OCH3-3′),3.51(2H,dd,J=6.0,8.4 Hz,H-9b,H-9b′),2.52(2H,dd,J=6.6,13.2 Hz,H-7b,H-7b′),2.50(2H,dd,J=7.2,13.2 Hz,H-7a,H-7a′),2.19(2H,m,H-8,H-8′).13C NMR(150 MHz,CD3OD)δC: 149.0(C-3,C-3′),145.9(C-4,C-4′),133.5(C-1,C-1′),122.3(C-6,C-6′),116.1(C-5,C-5′),l13.4(C-2,C-2′),74.5(C-9,C-9′),57.6(OCH3),47.8(C-8,C-8′),40.1(C-7,C-7′).上述數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致，故鑒定化合物2為3,4-二(4-羥基-3-甲基苯環(huán))四氫呋喃.

化合物3:無色顆粒狀晶體，分子式為C20H22O6.1H NMR(600 MHz,CDCl3)δH: 6.93(1H,s,H-2′),6.89(1H,s,H-2),6.76(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),6.87(2H,dd,J=1.8,7.2 Hz,H-6,6′),6.82(1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),5.59(1H,s,OH-4 or 4′),5.56(1H,s,OH-4 or 4′),4.84(1H，d，J=5.4 Hz，H-7′),4.40(1H,d,J=6.0 Hz,H-7),4.10(1H,d,J=9.6 Hz,H2-9 ax),3.90(3H,s,OMe),3.88(3H,s,OMe),3.82(2H,d,J=9.0 Hz,H2-9eq,9′eq),3.31(2H,m,H2-9′ax,H-8′),2.88(1H,m,H-8).13C NMR(150 MHz,CDCl3)δC: 133.2(C-1),130.5(C-1′),108.5(C-2′),108.7(C-2),146.6(C-3′),146.9(C-3),144.8(C-4′),145.5(C-4),114.4(C-5,5′),119.4(C-6),118.6(C-6′),82.3(C-7′),87.9(C-7),50.3(C-8′),54.7(C-8),69.9(C-9′),71.1(C-9),56.2(2OMe).上述數(shù)據(jù)與文獻[13]對照基本一致,故鑒定化合物3為表松脂醇.

化合物4:白色粉末，分子式為C20H22O6.1H NMR(600 MHz,CD3OD)δH: 6.95(2H,s,H-2,2′),6.77(2H,d,J=8.4 Hz,H-5,5′),6.81(2H,dd,J=1.8,7.2 Hz,H-6,6′),4.71(2H,d,J=4.2 Hz,H-7,7′),4.23(2H,dd,J=9.0,3.6 Hz,H-9 ax,9′ax),3.86(6H,s,2OMe),3.84(2H,dd,J=9.0,3.6 Hz,H-9eq,9′eq),3.15(2H,m,H-8,8′).13C NMR(150 MHz,CD3OD)δC: 133.9(C-1,1′),111.1(C-2,2′),149.3(C-3,3′),147.5(C-4,4′),116.2(C-5,5′),120.2(C-6,6′),87.7(C-7,7′),56.5(C-8,8′),72.7(C-9,9′),55.5(2OMe).上述數(shù)據(jù)與文獻[14]對照基本一致，故鑒定化合物4為松脂醇.

化合物5:白色晶體，分子式為C9H7NO.1H NMR(600 MHz,CD3OD)δH: 8.11(1H,s,NH),9.89(1H,s,CHO),8.16(1H,d,J=7.8 Hz,H-4),7.26(2H,m,H-5,6),7.48(1H,d,J=8.4 Hz,H-7).13C NMR(150MHz,CD3OD)δC:139.1(C-2),120.3(C-3),187.6(-CHO),125.9(C-4a),125.2(C-4),123.8(C-5),122.6(C-6),113.3(C-7),139.9(C-7a).上述數(shù)據(jù)與文獻[15]對照基本一致，故鑒定化合物5為3-吲哚甲醛.

化合物6:白色固體，分子式為C14H13NO4.1H NMR(600 MHz，CD3OD)δH: 7.44(1H,s,H-5),7.28(1H,s,H-8),7.72(1H,s,H-2′),7.17(1H,s,H-3′),4.46(3H,s,4-OCH3),3.97(3H,s,6-OCH3),3.94(3H,s,7-OCH3).13C NMR(150 Hz,CD3OD)δC: 164.5(C-2),114.1(C-3),157.8(C-4),101.7(C-5),154.6(C-6),149.4(C-7),106.5(C-8),103.6(C-4a),143.2(C-8a),144.0(C-2′),106.4(C-3′),60.0(4-OCH3),56.5(6-OCH3),56.4(7-OCH3).以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道基本一致，故確定化合物6為香草木寧.

化合物7:黃色晶體，分子式為C16H15NO4.1H NMR(600 MHz,CDCl3)δH:8.43(1H,d,J=7.8 Hz,H-8),7.28(1H,t,J=7.2 Hz,H-7),7.71(1H,t,J=7.2Hz,H-6),7.50(1H,d,J=7.2 Hz,H-5),6.26(1H,s,H-4),4.00(3H,s,2-OCH3),3.91(3H,s,3-OCH3),3.83(3H,s,N-CH3),14.75(1H,s,1-OH).13C NMR(150 MHz,CDCl3)δC: 156.5(C-1),130.5(C-2),159.5(C-3),87.0(C-4),114.8(C-5),134.2(C-6),121.7(C-7),127.0(C-8),181.1(C-9),140.8(C-4a),142.3(C-5a),121.0(C-8a),106.1(C-9a),56.2(2-OCH3),61.0(3-OCH3),34.4(N-CH3).以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道基本一致，故鑒定化合物7為山小桔堿.

化合物8:白色片狀結(jié)晶，分子式為C21H32O2.1H NMR(600 MHz,CD3OD)δH: 5.35(1H,m,H-6),3.40(1H,m,H-3),2.65(1H,t,J=9.0 Hz,H-17),2.13(3H,s,H3-21),1.03(3H,s,H3-19),0.63(3H,s,H3-18).13C NMR(150 MHz,CD3OD)δC: 212.6(C-20),142.4(C-5),122.4(C-6),72.5(C-3),64.8(C-17),58.3(C-14),51.7(C-9),45.3(C-13),40.0(C-12),38.7(C-1),43.1(C-4),33.4(C-8),33.0(C-7),31.8(C-21),37.9(C-10),25.6(C-15),23.9(C-16),13.7(C-18),20.0(C-19).以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致，鑒定化合物8為孕烯醇酮.

化合物9:白色片狀結(jié)晶，分子式為C21H30O2.1H NMR(600 MHz,CD3OD)δH: 5.37(1H,m,H-6),3.41(1H,m,H-3),6.91(1H,dd,J=1.8,3.6 Hz,H-16),2.26(3H,s,H3-21),1.07(3H,s,H3-19),0.93(3H,s,H3-18).13C NMR(150 MHz,CD3OD)δC: 199.6(C-20),142.8(C-5),122.2(C-6),72.5(C-3),156.5(C-17),58.0(C-14),52.3(C-9),47.4(C-13),36.1(C-12),38.6(C-1),43.2(C-4),31.7(C-8),32.4(C-7),27.3(C-21),38.0(C-10),33.4(C-15),147.6(C-16),16.3(C-18),19.9(C-19).以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道基本一致，鑒定化合物9為16-妊娠雙烯醇酮.

化合物10:無色油狀物，分子式為C15H24O3.1H NMR(600 MHz,CD3OD)δH:2.17(2H,dd,J=3.9,9.3 Hz,H-2),1.71(1H,m,H-3a),1.93(1H,m,H-3b),1.67(1H,d,J=12.0 Hz,H-5),0.49(1H,dd,J=9.6,12.0 Hz,H-6),0.75(1H,m,H-7),2.04(2H,m,H2-8),2.24(1H,dd,J=6.0,13.2,H-9a),2.57(1H,t,J=13.2,H-9b),1.06(3H,s,H3-12),0.99(3H,s,H3-13),4.85(1H,m,H-14a),4.89(1H,m,H-14b),1.26(3H,s,H3-15).13C NMR(150 MHz,CD3OD)δC: 97.1(C-1),30.1(C-2),40.9(C-3),81.7(C-4),58.7(C-5),23.4(C-6),29.1(C-7),26.7(C-8),35.1(C-9),154.4(C-10),20.9(C-11),29.4(C-12),16.1(C-13),111.9(C-14),27.5(C-15).以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道基本一致，鑒定化合物10為lochmolin E.

4 結(jié)語

前期對五葉山小橘葉的分離主要得到生物堿[3,20]，本文對五葉山小橘葉進行系統(tǒng)分離，除了得到3個生物堿外，還得到4個木脂素、2個甾體、1個萜類.分別鑒定為：山小橘新木脂烷甲素 (1)、3,4-二(4-羥基-3-甲基苯環(huán))四氫呋喃 (2)、表松脂醇(3)、松脂醇(4)、3-吲哚甲醛 (5)、香草木寧(6)、山小桔堿(7)、pregnenolone(8)、16-dehydropregnenolone (9)、 lochmolin E(10).其中化合物1為新的4′,7-環(huán)氧-8,3′新木脂烷類化合物，化合物2～4、8～10是首次從該屬植物中分離得到.化合物10原是從海洋生物軟珊瑚中分離得到，這是首次從陸生植物中分離得到.木脂素、甾體、萜類化合物的分離，說明了五葉山小橘葉化學(xué)成分呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)多樣性，為進一步研究和開發(fā)五葉山小橘葉提供了理論依據(jù).