木蝴蝶水提物對家兔離體腸平滑肌活動(dòng)的影響

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣西 百色 533000； 2.右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院2014級本科1班，廣西 百色 533000； 3. 右江民族醫(yī)學(xué)院有機(jī)化學(xué)與藥物化學(xué)教研室，廣西 百色 533000)

木蝴蝶是紫葳科木蝴蝶屬木蝴蝶[oroxylumindicum(L.)Vent]的成熟種子，種子極扁薄，呈橢圓形片狀，外種皮除基部一邊外，其余三邊延長成膜翅狀，形如蝶翅，邊緣多破裂，長5.5～8 cm，橫徑約4 cm，白色有絹樣光澤，并有放射狀紋理，氣微、味苦[1]。木蝴蝶又名海船、牛腳簡等，其最早記載于《滇南本草》，距今已有幾百年的藥用歷史。木蝴蝶分布于廣西、廣東、云南、貴州等地，作為一種中藥，可用于喉嚨痛、肺熱咳嗽、肝胃脹痛等[2]。木蝴蝶對胃腸平滑肌自發(fā)性收縮的影響及作用機(jī)制研究未見報(bào)道，本次實(shí)驗(yàn)通過使用BL-420F生物信號采集與分析系統(tǒng)采集信號并處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方法，觀察低、高濃度木蝴蝶水提物對十二指腸平滑肌收縮活動(dòng)的影響。旨在為該藥的藥效研究及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康家兔8只，體重1.5～2.0 kg，雌雄兼半，由右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號：SYXK桂2017-0004。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及器械 HW-400E型恒溫平滑肌槽(成都泰盟科技有限公司)，BL-420F生物信號采集與分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，BS600L電子天平(上海友聲衡器有限公司)，培養(yǎng)皿，移液器，玻璃器皿，手術(shù)刀、手術(shù)剪、手術(shù)鑷、組織鉗。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 按《實(shí)驗(yàn)生理科學(xué)》[3]方法配制的臺氏液；0.01%乙酰膽堿溶液(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；0.05% 硫酸阿托品注射液(河南潤弘制藥有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥材 木蝴蝶采自廣西壯族自治區(qū)南寧市武鳴區(qū)，經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室劉春榮老師鑒定為紫葳科木蝴蝶屬木蝴蝶。

1.5 方法

1.5.1 木蝴蝶水提物制備 稱取10 g木蝴蝶，加適量水浸潤30 min，在電爐上煎煮微沸1 h ，濾出濾液，再次加水適量煎煮微沸30 min，濾出濾液，兩次濾液合并蒸發(fā)濃縮，加水調(diào)制至10 ml，即得每毫升水提液含生藥1.0 g木蝴蝶煎劑。

1.5.2 離體腸管標(biāo)本的制備 取潔凈家兔8只，實(shí)驗(yàn)前24 h禁食不禁水，用木槌敲擊后枕部致其昏迷，快速使用手術(shù)解剖器械剖開腹腔，在胃幽門和十二指腸交界處為起點(diǎn)剪取一段約16 cm的十二指腸，放入裝有(37±0.5)℃臺氏液的器皿中，通入空氣，用臺氏液洗去腸內(nèi)容物，除去腸系膜和脂肪，后剪取成約2 cm的小段[4]，每只家兔取8段腸管做樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，放置于臺氏液中備用。

1.5.3 木蝴蝶水提物對家兔離體小腸平滑肌活動(dòng)的影響 將BL-420F生物信號采集與分析系統(tǒng)與電腦連接好，打開系統(tǒng)，在一通道連接好張力換能器，調(diào)零，定標(biāo)，調(diào)節(jié)好HW-400E型恒溫平滑肌槽，加入臺氏液，至液面到加藥筒刻度線上沿，水溫設(shè)定在38℃；取一節(jié)腸段，腸段一端連接在換能器上，另一端連接在L型通氣鉤上[5]，標(biāo)本垂直懸掛于液面下，不觸碰加藥筒內(nèi)壁，保持外周恒溫液面與加藥筒內(nèi)的液面相平，調(diào)節(jié)通氣量，保持出氣泡的速度以不沖動(dòng)腸段標(biāo)本為合適[6]。調(diào)節(jié)收縮基線，以前負(fù)荷1 g，平衡10 min，等待曲線描記穩(wěn)定好開始實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分成3組：正常對照組、木蝴蝶水提物低濃度(4 g/L)組和高濃度(8 g/L)組。在每只家兔取出的腸管中，隨機(jī)取3段腸管，隨機(jī)分入正常對照組、低濃度組和高濃度組中，其中，正常對照組給予等容積臺氏液，受試藥濃度為1 g/ml的木蝴蝶水提液，每次加入100 μl，給藥濃度累積變大(即換算成50 ml麥?zhǔn)显〔壑兴幬锏慕K濃度分別為4 g/L、8 g/L)，記錄小腸平滑肌收縮的平均張力和頻率，在每次給完藥后，用清潔的臺氏液沖洗標(biāo)本至少3次，等待標(biāo)本恢復(fù)收縮后，再進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

1.5.4 木蝴蝶水提物對乙酰膽堿誘導(dǎo)平滑肌收縮活動(dòng)的影響 在正常臺氏液環(huán)境下，實(shí)驗(yàn)分成3組，正常對照組、乙酰膽堿組、乙酰膽堿加木蝴蝶組。在每只家兔取出的腸管中，隨機(jī)取3段腸管，隨機(jī)分入正常對照組、乙酰膽堿組、乙酰膽堿加木蝴蝶組中，其中，正常對照組給予等容積臺氏液，待小腸平滑肌自主活動(dòng)穩(wěn)定后，先加入工具藥0.01%乙酰膽堿[5]( 即換算成 50 ml麥?zhǔn)显〔壑兴幬锏慕K濃度為2 g/L) 記錄1 min，然后再逐步加入1 g/ml的木蝴蝶水提物，每次100 μl，當(dāng)達(dá)到高(8 g/L)濃度的木蝴蝶水提物藥液時(shí)，分別記錄2 min。

1.5.5 木蝴蝶水提物對阿托品誘導(dǎo)平滑肌舒張活動(dòng)的影響 在正常臺氏液環(huán)境下，實(shí)驗(yàn)分成3組，正常對照組(與1.5.4共用對照組)、阿托品組、阿托品加木蝴蝶組。在每只家兔取出的腸管中，隨機(jī)取2段腸管，隨機(jī)分入阿托品組，阿托品加木蝴蝶組中，等待小腸平滑肌自主活動(dòng)穩(wěn)定后，加入工具藥0.05%硫酸阿托品[5]50 μl(即換算成50 ml麥?zhǔn)显〔壑兴幬锏慕K濃度為1 g/L)。記錄1 min，然后再逐步加入1 g/ml的木蝴蝶水提物，每次100 μl，當(dāng)達(dá)到高濃度(8 g/L)的木蝴蝶水提物藥液時(shí)，分別記錄2 min。

1.5.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測量 測量1 min內(nèi)的活動(dòng)曲線平均張力(g)，測量1 min內(nèi)的活動(dòng)曲線波形個(gè)數(shù)為收縮頻率(次/分)。給藥前和給藥后1 min分別測量平均張力和收縮頻率[6]。

2 結(jié)果

2.1 木蝴蝶水提物對家兔離體小腸平滑肌活動(dòng)的影響 組內(nèi)比較，正常對照組給藥前后平均張力變化無差異(P>0.05)；木蝴蝶低、高濃度組給藥前后比較，平均張力均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；收縮頻率組內(nèi)比較無顯著變化(P>0.05)；組間比較，給藥前平均張力組間兩兩比較，無明顯變化(P>0.05)；給藥后木蝴蝶低、高濃度組平均張力較正常對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)；低、高濃度組互相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；給藥前后的小腸平滑肌活動(dòng)頻率組間兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，木蝴蝶水提物在本實(shí)驗(yàn)劑量下，對離體小腸平滑肌的活動(dòng)有抑制作用，使其平均張力下降，對頻率無影響，且無量效關(guān)系，見表1。

表1 木蝴蝶水提物對離體小腸平滑肌自主活動(dòng)的影響

注：與給藥前比較，a：P<0.01；與給藥后的正常對照組比較，b：P<0.01

2.2 木蝴蝶水提物對乙酰膽堿誘導(dǎo)平滑肌收縮活動(dòng)的影響 組內(nèi)比較，正常對照組給藥前后平均張力變化無差異(P>0.05)；乙酰膽堿組給藥前后比較，平均張力上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；乙酰膽堿+木蝴蝶高濃度組給藥前后比較，平均張力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；各組給藥前后頻率變化不明顯(P>0.05)；組間比較，給藥前的平均張力比較，三個(gè)組兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；給藥后平均張力比較，與正常對照組比較，乙酰膽堿組給藥后平滑肌平均張力上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與乙酰膽堿組比較，乙酰膽堿+木蝴蝶水提物高濃度組給藥后離體小腸平滑肌平均張力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；各組間離體小腸平滑肌活動(dòng)頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)劑量下的木蝴蝶水提物對乙酰膽堿誘導(dǎo)的平滑肌收縮活動(dòng)有拮抗作用，但對頻率無影響，見表2。

2.3 木蝴蝶水提物對阿托品誘導(dǎo)平滑肌舒張活動(dòng)的影響 組內(nèi)比較，正常對照組給藥前后平均張力和頻率變化無差異(P>0.05)；阿托品組給藥前后比較，平均張力下降，頻率減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；阿托品+木蝴蝶高濃度組給藥前后比較，平均張力下降，頻率減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；組間比較，給藥前平均張力三個(gè)組兩兩比較差異不明顯(P>0.05)；給藥后平均張力比較，與正常對照組比較，阿托品組給藥后平滑肌平均張力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與阿托品組比較，阿托品+木蝴蝶水提物高濃度組平滑肌平均張力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，給藥前后頻率組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)劑量下的木蝴蝶水提物對阿托品誘導(dǎo)的平滑肌舒張活動(dòng)有協(xié)同作用，促使平滑肌平均張力進(jìn)一步下降，見表3。

表2 木蝴蝶水提物對乙酰膽堿誘導(dǎo)平滑肌收縮活動(dòng)的影響

注：與給藥前比較，a：P<0.01；與正常對照組比較，b：P<0.01；與乙酰膽堿組比較，c：P<0.01

表3 木蝴蝶水提物對阿托品誘導(dǎo)平滑肌舒張活動(dòng)的影響

注：與給藥前比較，a：P<0.05，b：P<0.01；與正常對照組比較，c：P<0.01；與阿托品組比較，d：P<0.01

3 討論

木蝴蝶是紫葳科木蝴蝶屬木蝴蝶植物，其性涼，味甘、苦。常用于肝胃脹痛、肺熱咳嗽等病癥。有文獻(xiàn)[2，7]報(bào)道，木蝴蝶的化學(xué)成分較為復(fù)雜，以苷類化合物、黃酮多見，也有一些如有機(jī)酸類化合物、對羥基苯乙醇等化合物，其多數(shù)藥理作用得以在臨床應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)濃度的木蝴蝶水提物對平滑肌自主收縮活動(dòng)有抑制作用，能夠拮抗乙酰膽堿誘導(dǎo)的平滑肌收縮作用，同時(shí)對于阿托品誘導(dǎo)的平滑肌舒張活動(dòng)有協(xié)同作用，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上與民間藥用效果是一致的。

小腸的常見運(yùn)動(dòng)形式有緊張性收縮、蠕動(dòng)和分節(jié)運(yùn)動(dòng)，其節(jié)律性收縮活動(dòng)易受神經(jīng)遞質(zhì)和激素等因素的影響，小腸離體后，雖然失去了外來神經(jīng)支配，但其壁內(nèi)神經(jīng)叢還存在，如果將小腸放置于適宜的環(huán)境條件下，小腸依然可以自主收縮活動(dòng)。我們通過小腸平滑肌收縮和舒張活動(dòng)情況以及頻率變化來判斷小腸興奮性[8]。

本實(shí)驗(yàn)中，在乙酰膽堿的作用下，離體小腸平滑肌出現(xiàn)了膽堿能激動(dòng)的效果，表現(xiàn)為平滑肌收縮加強(qiáng)，平均張力上升；在阿托品作用下，出現(xiàn)了膽堿能阻斷效果，表現(xiàn)為收縮減弱，平均張力下降，這些結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)用的離體小腸對藥物反應(yīng)正常[9]。實(shí)驗(yàn)中設(shè)定乙酰膽堿和阿托品為模型對照組，旨在探明木蝴蝶水提物的作用位點(diǎn)。多數(shù)研究認(rèn)為，平滑肌上有M受體，α、β受體，組胺受體等，以及一些離子通道，如鈣離子通道等[10-11]。乙酰膽堿激動(dòng)M受體后，可促使細(xì)胞中的第二信使三磷酸肌醇和二酰甘油濃度增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放，引發(fā)收縮反應(yīng)。使得平滑肌張力上升。乙酰膽堿引起的小腸平滑肌收縮，跟細(xì)胞中的鈣離子濃度增多有關(guān)[11-12]。所以，推測木蝴蝶水提物抑制小腸平滑肌收縮活動(dòng)也有可能與降低細(xì)胞中鈣離子濃度有關(guān)。

阿托品是膽堿能M受體的阻斷劑，可與M受體結(jié)合并占領(lǐng)其位點(diǎn)而導(dǎo)致競爭性拮抗乙酰膽堿的激動(dòng)作用[13-14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，先加入阿托品，阻斷小腸平滑肌M受體使其舒張，平均張力下降，再加入木蝴蝶水提物，其平均張力進(jìn)一步下降，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，木蝴蝶水提物有可能是通過阻斷M受體而導(dǎo)致小腸平滑肌收縮活動(dòng)受到抑制。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，木蝴蝶水提物可抑制離體小腸平滑肌的自主收縮活動(dòng)，降低平均張力，可能與降低平滑肌細(xì)胞中鈣離子濃度，以及阻斷M受體有關(guān)。是否還有其它作用機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)也為木蝴蝶用于治療胃腸痙攣性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。