HPLC-DAD法同時測定三種來源丹參飲片中水溶性和脂溶性成分

張敏敏，趙志國，劉偉，崔莉，王岱杰，王曉，趙恒強

(齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)山東省分析測試中心 山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東 濟南 250014)

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖[1]，現(xiàn)代藥理學研究表明，丹參具有抗血栓、抗炎、抗氧化、改善微循環(huán)等作用[2-4]，臨床上廣泛用于心腦血管等疾病的治療。丹參主要產(chǎn)地包括山東、河南、四川以及云南等地，其中，山東已成為當前全國最大的丹參產(chǎn)地和丹參制商品集散地[5]。四川為丹參的道地產(chǎn)區(qū)，是臨床上公認的丹參質量最佳產(chǎn)區(qū)。不同來源丹參飲片質量存在參差不齊的情況，而有關這種差異情況缺乏系統(tǒng)的研究，嚴重制約著各地丹參的充分開發(fā)利用。

丹參的有效成分主要是脂溶性的丹參酮類和水溶性的丹酚酸類[6-8]。目前，2015版《中國藥典》對于丹參的質控要求僅限于規(guī)定隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA三種丹參酮總含量和一種丹酚酸(丹酚酸B)的含量[1]。中藥是多成分、多靶點的復雜體系，有限的指標難以全面反映中藥的質量。而且，藥典中丹參酮和丹酚酸的測定需采用不同的條件進行，測定方法較為復雜繁瑣。近年來，已有學者發(fā)展了丹參酮和丹酚酸的HPLC同時測定方法[9-12]，為本研究提供了技術參考。

本研究發(fā)展了超聲輔助提取-HPLC-DAD同時測定丹參飲片中6種水溶性和脂溶性化學成分(咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA)的方法，并對不同來源的丹參飲片進行對比研究，研究結果將為丹參飲片的合理利用和質量評價研究提供數(shù)據(jù)支持。

2 材料與方法

2.1 實驗儀器及材料

Thermo Scientific UltiMate 3000超高效液相色譜儀(美國Thermo Scientific公司)，配有二元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器；CPA225D型十萬分之一電子分析天平(德國Sartorius公司)；SB-5200D型高功率數(shù)控超聲波儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；FW100型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

對照品為咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA(上海源葉生物科技有限公司,純度均大于98%)；甲醇、乙腈(美國Tedia公司，色譜純)；乙醇(國藥集團，分析純)；甲酸(美國ROE公司，色譜純)。丹參樣品購于濟南市各藥店及藥材市場，經(jīng)山東省分析測試中心王曉研究員鑒定為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根莖。具體樣品信息見表1。

表1 樣品信息

續(xù)表1

2.2 實驗方法

2.2.1 供試品溶液的制備

取丹參飲片粉碎，過4號篩。精密稱取丹參藥材粉末0.2 g，加入20 mL 80%甲醇水溶液，稱重，超聲恒溫提取30 min，冷卻至室溫稱重后用80%甲醇水溶液補足失重。提取液經(jīng)0.22 μm濾膜抽濾后備用。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA 對照品適量，加甲醇配制成濃度分別為1.70、2.40、1.00、1.30、1.20、1.00 mg·mL-1的對照品儲備溶液，4 ℃存儲備用。使用時，用甲醇稀釋上述標準儲備溶液，配制成不同濃度的單標溶液。各取單標溶液適量，配制所需濃度的混合標準溶液。

2.2.3 色譜條件

Luna C18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)柱。流動相A為乙腈，流動相B為水(0.6 %乙酸)，流速1.0 mL·min-1，進樣量10 μL，檢測波長254 nm。梯度洗脫：0～5 min，3%～7% A；5～8 min，2%～22% A；8～15 min，22%～70% A；15～25 min，70%～90% A；25～30 min，90%～100% A。

3 結果與討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

本文考察了Kromosial C18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)、Agilent SB C18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)、Agilent TC C18(4.6×250 mm，5.0 μm)和Luna C18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)色譜柱針對丹參中咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA 6種成分的分離效果。結果表明，采用Luna C18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)色譜柱時，峰型和分離度較好。因此，選用Luna C18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)色譜柱對丹參飲片提取物進行色譜分析。

對比了相同比例的乙腈-水和甲醇-水體系對提取物的分離效果。結果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈-水體系時，丹參飲片提取物分離效果明顯較好，故采用乙腈-水體系作為流動相。由于丹參提取物成分復雜，等度洗脫難以實現(xiàn)上述6種成分的色譜分離，因此采用梯度洗脫對丹參提取物進行分析。

咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B等成分屬于酸性成分，易造成色譜峰拖尾，在流動相中加入一定量的弱酸可以抑制有機酸的電離從而改善色譜峰峰型。考察了水相分別加入不同比例的乙酸(0.2%、0.4%、0.6%和0.8%)對丹參提取物色譜分離的影響，結果發(fā)現(xiàn)水相中加入0.6%乙酸時色譜峰對稱性較好、峰型尖銳。

另外，柱溫對色譜峰分離度、峰型和保留時間等均具有一定的影響。先后調節(jié)柱溫箱溫度在25、30、35、40和45 ℃時比較得出，當柱溫為40 ℃時，色譜峰分離度和峰型明顯較好，可以用于后續(xù)研究。

在波長選擇上，經(jīng)二極管陣列檢測器考察各類成分在不同波長(190～600 nm)下的紫外吸收波長。結果表明，在254 nm下各類成分均有吸收，且各化合物具有較好的分離度和靈敏度，因此選擇254 nm作為檢測波長。在優(yōu)化后的色譜條件下，丹參提取物的色譜分離圖如圖1所示。

1 咖啡酸；2 迷迭香酸；3 丹酚酸B；4 二氫丹參酮Ⅰ；5 隱丹參酮；6 丹參酮ⅡA

3.2 方法學考察

3.2.1 線性關系考察

分別精密吸取6種對照品溶液適量，按照不同比例稀釋得到不同濃度的混合對照品溶液。按照3.1的色譜條件進樣分析，以峰面積為縱坐標(y)，化合物濃度為橫坐標(x)繪得各化合物標準曲線，各化合物的回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍、檢測限(3倍信噪比計算)、定量限(10倍信噪比計算)見表2 。由表2中可以看出，在給出的線性范圍內各化合物所建立的標曲線性良好，可以用于后續(xù)的定量分析。

表2 6種成分的回歸方程、檢測限和定量限

3.2.2 精密度實驗

精密稱定丹參樣品0.2 g，處理后按2.2.3的色譜條件連續(xù)進樣6次，分別測出6種化合物的峰面積和保留時間，計算出各個化合物的峰面積和保留時間的相對標準偏差。6種化合物峰面積的相對標準偏差分別為2.294%、0.804%、1.000%、2.914%、0.329%、0.081%；保留時間的相對標準偏差分別為0.020%、0.025%、0.083%、0.013%、0.015%、0.011%，說明儀器精密度良好。

3.2.3 重復性實驗

精密稱定同一丹參樣品6份，分別用2.2.1制備供試品溶液的方法處理，精密吸取5 μL進樣分析，經(jīng)過計算得到6種化合物峰面積的相對標準偏差分別為2.692%、2.451%、2.380%、1.944%、2.137%、2.952%；保留時間的相對標準偏差分別為0.210%、0.020%、0.031%、0.041%、0.034%、0.173%，說明該方法的重現(xiàn)性較好。

3.2.4 穩(wěn)定性實驗

取丹參樣品分別于0 、2 、4 、8 、12 、24 h進樣分析，檢測和計算得到6種化合物峰面積的相對標準偏差分別為3.333%、2.659%、2.305%、1.620%、0.961%、2.512%；保留時間的相對標準偏差分別為0.020%、0.053%、0.115%、0.008%、0.012%、0.010%。由于其保留時間的相對標準偏差均小于1%，峰面積的相相對標準偏差均小于4%，說明該樣的化學性質在24 h內較穩(wěn)定。

3.2.5 加標回收率

精密稱取丹參樣品6份，每份0.2 g，分別精密稱定加入咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA標準品適量，按上述供試品溶液制備方法處理后進樣分析。其平均回收率(n=6)分別為94.42%、92.32%、101.04%、94.82%、95.39%、104.19%，相對標準偏差分別為2.87%、1.98%、3.01%、2.95%、3.71%和4.19%。結果表明，各目標成分加標回收率為92.32%～104.19%，回收率良好。

3.3 含量測定

取17批不同來源的丹參樣品，采用2.2.1樣品溶液制備方法進行制備，分別進樣分析，得出上述6種化合物的相應峰面積，根據(jù)上述方法中回歸方程算出各化合物的含量，平行3次取平均值。

利用Origin7.5 對所有含量測定數(shù)據(jù)按來源分組處理，得到帶誤差棒的柱狀圖，見圖2。由圖2中可以看出，來源于四川的丹參飲片中的6種成分含量均高于源自山東和云南的，尤其以丹酚酸B、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量較為明顯。6種成分的總平均含量為 (11.72±0.71)mg·g-1。

圖2 三組丹參飲片中各化合物含量柱狀圖

不同來源丹參飲片中各化合物的含量均有差異。山東產(chǎn)丹參飲片的二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA 3種丹參酮的含量高于云南產(chǎn)丹參飲片，來源于山東和云南的丹參飲片中上述3種丹參酮總含量分別為 (3.52±0.17)mg·g-1和(3.14±0.17)mg·g-1。而源自山東的丹參飲片中咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B的含量低于源自云南的丹參飲片，這兩個地區(qū)丹參飲片中3種酚酸總含量分別為(37.75±2.26)mg·g-1和(54.09±0.27)mg·g-1。

3.4 聚類分析

聚類分析又稱群分析，是研究樣品或指標分類問題的一種統(tǒng)計分析方法，同時也是數(shù)據(jù)挖掘的一個重要算法。本研究中以17批不同來源的丹參飲片樣本為研究對象，以HPLC法測得的6種水溶性和脂溶性成分的含量為變量，進行聚類分析，以得到各樣本間的聚集關系，見圖3。

圖3 17批丹參飲片樣本的聚類分析圖譜

由聚類結果可以看出，圖3中1～10批樣本為一組，11～14號樣本為一組，15～17號樣本為一組分別聚集，結合表1中樣品來源信息可知這三組樣本分別來源于山東、四川和云南，該聚集關系與樣品信息高度一致。其中四川組和云南組聚集關系較近，推測可能是由于四川與云南地理來源較為接近，丹參藥材的種植條件(環(huán)境、氣候等)較為相似，造成所含化學成分具有相似的分布規(guī)律。其次，各組內部也存在聚集關系差異，11～14號樣本組即四川組樣本中，11、12號和13、14號分別聚集較近，可能是由于這兩組飲片分別來源于四川不同產(chǎn)區(qū)。山東組中由于樣本量較大且來源復雜，其內部聚集劃分等級和組別較多。

可以看出，采用本研究測定的丹參中6種水溶性和脂溶性成分含量結果結合聚類分析，可以較好地實現(xiàn)對不同來源丹參飲片樣品的區(qū)分，可以較為明顯地表現(xiàn)出各樣本間的差異關系。

4 結論

本研究發(fā)展了超聲輔助提取-HPLC-DAD同時測定丹參飲片中6種成分，即咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的方法。研究表明，該方法簡單、快速，可以實現(xiàn)丹參中不同極性成分的同時提取、分析。應用該方法對山東、四川和云南不同來源的丹參飲片進行分析表明，三個來源丹參飲片中各化合物的含量均存在一定差異，結合聚類分析可以實現(xiàn)其來源區(qū)分，進一步證明了其產(chǎn)地差異性。

但由于受到樣品數(shù)量的限制，詳細的差異分析有待進一步研究。本研究為了解不同來源丹參飲片的質量現(xiàn)狀及合理利用提供了科學依據(jù)。