釩在不同品種玉米幼苗中的亞細胞分布和動態(tài)變化

侯明 ，楊心瀚 ，霍巖 ，羅萍

1. 桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西 桂林 541004；2. 廣西高校食品安全與檢測重點實驗室，廣西 桂林 541004

釩（V）是人和動物必需的微量元素，但超過一定限度有害人體健康。V 不是植物必須的微量元素，過量V 會影響大豆和水稻的正常生長（鄒寶方等，1992；侯明等，2014）。V 顯著影響鷹嘴豆植物中蛋白質(zhì)含量，使植物生物量和根長等明顯減少（Imtiaz et al.，2015）。有研究表明，V 對植物更具流動性和毒性（Panichev et al.，2006；Xiao et al.，2015；Larsson et al.，2013），因此，了解V 的生物學作用對評價V 對環(huán)境和生物系統(tǒng)的潛在風險很重要。近年來，V污染對土壤和生物的影響已引起人們關注，Saco et al.（2013）研究了V 脅迫下菜豆（Phaseolus vulgarisL. cv）根和葉的形貌和超微結構，表明當V 處理濃度增加，菜豆根和葉形貌發(fā)生變化，葉片中葉綠體數(shù)量減少，細胞類囊體解體，葉V 含量總是遠低于根V 含量。Tian et al.（2014）研究發(fā)現(xiàn)，土壤生物活性會提高大白菜對V 的提取性，大白菜主要在根部積累V，V 從根部到地面部分的轉(zhuǎn)運率較低。Teng et al.（2013）研究表明，土壤中加入V 質(zhì)量濃度為0—400 mg·kg-1，V 主要富集在苜蓿根部，在地上部分略有積累。Yang et al.（2017）研究了土壤中V 對大豆不同生長階段的毒性，高濃度V（Ⅴ）推遲了大豆萌發(fā)和生長，細胞壁V 濃度與根部總V 濃度比例隨土壤中V（Ⅴ）濃度增加而增加。Imtiaz et al.（2018）探明，V 誘導使鷹嘴豆生物量、根系和幼苗長度顯著降低，根系積累的V 大于幼苗；隨著V 濃度增加，酶活性（SOD、CAT 和POD）和離子泄漏呈線性增加，蛋白質(zhì)含量和耐受性指數(shù)顯著下降，細胞活力受到嚴重損害。這些研究表明，低濃度V 處理促進植物生長，高濃度V 對植物產(chǎn)生毒性。然而，迄今為止，植物對V 的耐受機制仍然有限，對V 污染地區(qū)環(huán)境進行準確的風險評估仍有困難。由于采礦和冶煉活動增加，在中國西南地區(qū)有26.49%土壤被V 污染（Yang et al.，2017），因此，有必要進一步探明土壤-植物系統(tǒng)中V 的生物利用率以及V 的植物毒性和耐性。

研究植物在重金屬脅迫下亞細胞組分的分布特征可以闡明植物的耐性機理。近年來，人們研究了玉米和水稻植株中Cd（Zhang et al.，2019；He et al.，2008；唐杰等，2016）和Y（Zheng et al.，2018），小麥中Pb 和Cu（楊素勤等，2015；蘇忠亮等，2018），以及大豆幼苗中Mo（Xu et al.，2018）的亞細胞分布。這些研究結果表明，金屬在植物細胞不同部位的分布大多數(shù)遵循：細胞壁＞可溶性分數(shù)＞細胞器的順序，在細胞壁和可溶性組分的所占比例之和可達85%以上，說明植物為了抑制重金屬對其的傷害，總會將金屬分布在對植物生長相對不太重要的細胞器官。但金屬在不同植物或同一物種不同品種中的細胞分布有顯著差異（Liu et al.，2014；Xin et al.，2017）。因此，研究V 在植物體內(nèi)的亞細胞分布，對闡明V 對植物的毒理和植物耐受性有重要意義。根據(jù)健康風險評估，廣西也被標記為V 的優(yōu)先控制區(qū)域（Yang et al.，2017），大量有色金屬的開采、冶煉和加工，使土壤受到不同程度V 污染，將會影響到玉米作物的生長發(fā)育，可能導致玉米產(chǎn)量和質(zhì)量降低，進而影響到人體健康。為了進一步闡明V在玉米作物的富集特性和毒性機理，筆者采用水培試驗，研究了V 污染下不同品種甜玉米幼苗中V 的亞細胞分布及動態(tài)變化，旨在為探明不同品種玉米體內(nèi)V 的富集規(guī)律和植物耐受機制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試玉米（Zea maysL.）種子選取廣西具有代表性且廣泛種植的益甜608（廣西浩凱生物科技有限公司）和美甜糯一號（大民種業(yè)股份有限公司）。

1.2 試驗設計和處理

挑選籽粒飽滿的玉米種子，置于質(zhì)量分數(shù)為0.3% H2O2中消毒30 min，用純水洗凈后溫水浸泡1h，于30 ℃烘箱中恒溫催芽。培育玉米所用的容器為30 cm×24 cm×10 cm 的不透明塑料方盆，盆上蓋有33 cm×26.5 cm 帶孔（48 個直徑2.3 cm 的孔洞）PVC 隔板。將已萌發(fā)小芽的玉米種子播種于隔板每個圓孔上的定植籃中，每盆定株48 株，24 h 供氧進行水培培養(yǎng)。待幼苗長至2 片葉時，用1/2 Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)，待玉米幼苗長至“兩葉一心”時，用Hoagland 全營養(yǎng)液培養(yǎng)，待玉米幼苗長到第3 片葉時，挑選長勢一致的幼苗用含V 的營養(yǎng)液培養(yǎng)。每個品種均設置4 個處理，V 脅迫質(zhì)量濃度分別為0、5、15、30 mg·L-1（V 以NH4VO3形式添加），每種處理重復5 盆，兩個品種共計40 盆，營養(yǎng)液每4 天更換一次（調(diào)節(jié)溶液pH 為5.5—6.5）。培養(yǎng)4、8、12 d 后分別采集每個處理80 株，10 株為一個試樣，分根和莖葉用清水沖洗（根系于0.02 mol·L-1EDTA 溶液中浸泡10 min，以除去表面吸附的金屬離子），再用純水洗凈。用濾紙吸干表面水分。將根系和莖葉分別剪碎，準確稱取根系0.50 g和莖葉2.00 g，置于-20 ℃冰箱中備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米組織的亞細胞組分分離方法

按楊居榮等（1993）方法改進。將適量冷藏的鮮樣與預冷的亞細胞提取液（0.05 mol·L-1Tris-HCl，pH 7.5，0.25 mol·L-1蔗糖和0.001 mol·L-1二硫蘇糖醇）以1:10（m/V）的比例混勻，在冰浴上迅速研磨成勻漿。使用差速離心技術分離植物組織。將勻漿液在冷凍離心機中以1 500 r·min-1離心20 min，沉淀部分為細胞壁（F1）；上清液繼續(xù)以2 500 r·min-1離心10min，沉淀部分為細胞核（F2），上清液再以10 000 r·min-1離心30 min，沉淀為線粒體和葉綠體（F3），上清液為可溶性溶液（F4），所有步驟在4 ℃下進行。

1.3.2 樣品中V 含量的測定

將一定量植物鮮樣磨成勻漿后，置于150 mL錐形瓶中（測定V 總量），同上述分離V 的亞細胞各組分一起，加入5:2（V/V）的HNO3和H2O2，置于數(shù)顯控溫電熱板上充分消化至澄清，純水定容后，利用 ICP-MS（1288090 iCAP Q Operating Manual，Rev.B）測定試樣中V 含量。采用國家標準物質(zhì)GBW 10015（GSB-6 菠菜）監(jiān)控樣品中V含量的測定結果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

轉(zhuǎn)運系數(shù)(translocation factor，TF)=莖葉V 質(zhì)量分數(shù)(μg·g-1)/根系V 質(zhì)量分數(shù)(μg·g-1)（Tiwari et al.，2011）。采用Microsoft Excel 2010 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，運用Duncan 多重比較法進行顯著性差異分析（P＜0.05）。結果以平均值±標準差（Mean±SD，n=3）表示。

2 結果與分析

2.1 不同品種玉米幼苗中V 的積累分布和轉(zhuǎn)運

由表1 可知，在不同時間不同的V 濃度處理下，兩個品種玉米根和莖葉中V 濃度均為：根遠大于莖葉。益甜608 根部V 含量約占總量的63.75%—98.82%，美甜糯一號為73.91%—98.65%，可見，根系是玉米吸收和儲存V 的主要部位，限制了V向地上部的運輸。在不同時間，隨著V 處理濃度增大，兩個品種玉米根部和莖葉中富集的V 含量升高，與對照比較差異顯著（P＜0.05）。在V 脅迫4、8 和12 d，V 處理從5 mg·L-1增至30 mg·L-1時，與對照相比較，益甜608 玉米根部V 含量分別增加了35.7—178.5、25.5—75.5、67.1—195.0 倍，莖葉增加了0.8—5.3、1.4—32.8、2.4—13.4 倍；美甜糯一號根部分別增加了24.9—81.7、10.2—44.9、178.1—231.6 倍，莖葉部分別增加了2.8—10.4、4.6—21.3、6.9—20.4 倍。顯然，兩個玉米品種根部V 含量的增幅遠大于莖葉部，脅迫12 d，美甜糯一號根部增幅大于益甜608。在相同V 濃度處理下，隨著V 脅迫時間增加，玉米不同器官中V 含量增大后又降低，在脅迫8 d 時達最大。當V 處理為30 mg·L-1，脅迫8 d，益甜608 根部V 質(zhì)量分數(shù)達305.74 μg·g-1，莖葉中V 質(zhì)量分數(shù)為18.14 μg·g-1；美甜糯一號根部為319.80 μg·g-1，莖葉部為8.41 μg·g-1，與對照比較差異顯著（P＜0.05）。說明兩個品種玉米對V吸收積累的特性差異在莖葉表現(xiàn)得更明顯。

表1 兩種玉米根和莖葉中V 質(zhì)量分數(shù) Table 1 Mass fraction of V in shoots and roots of two sweet maize varieties ω(Fresh)/(μg·g-1)

不同脅迫時間，玉米幼苗對V 的轉(zhuǎn)運系數(shù)（TF值）變化不同。隨著V 處理濃度增大，除對照外，在V 脅迫4 d，植物對V 的轉(zhuǎn)運系數(shù)呈逐漸減小的趨勢；在8 d 和12 d 的TF 值則有所增加，但始終小于對照（表1）。在V 處理濃度范圍內(nèi)，益甜608 的TF 值變化范圍為0.568—0.016，美甜糯一號的TF 值在0.353—0.014。除對照外，隨著脅迫時間增加，兩個品種玉米幼苗的轉(zhuǎn)運系數(shù)大多呈現(xiàn)升高后降低的變化趨勢，在V 處理8 d，益甜608 和美甜糯一號的最大TF 值分別為0.059 和0.036，均小于0.1。兩個品種玉米幼苗具有較低的TF 值，表明V 由植株根部向地上部轉(zhuǎn)運的能力受限，植物的這種主動保護可使地上部組織免受過量V 的傷害。

表2 兩種玉米幼苗根中V 的亞細胞分布 Table 2 Subcellular distribution of V in roots of two sweet maize cultivars seedlings ω(Fresh)/(μg·g-1)

圖1 兩種玉米幼苗根中V 的亞細胞分配比例 Fig. 1 Subcellular distribution proportion of V in roots of two sweet maize varieties seedlings

2.2 不同品種玉米幼苗根中V 的亞細胞分布

亞細胞分析結果（表2，圖1）可見，不同V濃度處理下，不同品種玉米根中V 的亞細胞分布比例順序為：益甜608，細胞可溶性組分(F4)＞細胞壁(F1)＞細胞核(F2)＞線粒體和葉綠體（F3），F(xiàn)4和F1二者比例之和為72.34%—83.75%；美甜糯一號，細胞壁(F1)＞細胞可溶性組分(F4)＞細胞核(F2)＞線粒體和葉綠體（F3），F(xiàn)1和F4比例之和為76.24%—85.98%。兩個品種玉米根系在細胞器（F2和F3）中分配較少（14.02%—27.66%），可見，在玉米根部，V 被固定在細胞壁和液泡區(qū)格化，進入細胞器的V 較少。隨著V 處理濃度的增加，玉米根系亞細胞各組分V含量明顯增加，與對照比較差異顯著（P＜0.05）（表2）。兩個品種玉米根系亞細胞組分含量分配比變化相似，隨著V 處理濃度增加，F(xiàn)1分配比例增大，而F4分配比例下降，益甜608 和美甜糯一號的F1分配比例分別從 22.04%和 30.31%增加到57.11%和62.15%，F(xiàn)4的從50.30%和45.94%降低到26.64%和23.82%，而F2和F3的分配比例變化不大（圖1）。

2.3 不同品種玉米幼苗莖葉中V 的亞細胞分布

由表3 圖2 可知，兩個品種玉米莖葉的亞細胞各組分V 含量分配比例表現(xiàn)出不同規(guī)律，益甜608的細胞可溶性組分(F4)＞細胞壁(F1)＞細胞核(F2)=線粒體和葉綠體（F3），F(xiàn)4和F1二者比例之和為75.84%-82.34%；低質(zhì)量濃度V 處理（＜15 mg·L-1）時，美甜糯一號的細胞可溶性組分(F4)＞細胞壁(F1)＞細胞核(F2)=線粒體和葉綠體（F3），高質(zhì)量濃度V 處理（≥15 mg·L-1）時，細胞壁(F1)＞細胞可溶性組分(F4)＞線粒體和葉綠體(F3)＞細胞核（F2），F(xiàn)1和F4比例之和為71.94%-86.55%。隨著V 處理濃度增大，美甜糯一號莖葉亞細胞各組分的V 含量差異均達顯著水平（P＜0.05），益甜608 除脅迫4 d 外，其余亞細胞組分V 含量在低濃度V 處理下差異均不顯著（P＜0.05）（表3）。與根部比較，不同品種玉米莖葉部亞細胞組分含量分配比變化有所不同，益甜608 的F1分配比下降（44.61%—25.88%），F(xiàn)4分配比升高（31.33%—55.29%）；而美甜糯一號的F1分配比升高（23.52%—53.94%），F(xiàn)4的分配比下降（48.42%—32.62%），玉米莖葉的F2（12.55%—9.31%）和F3（11.71%—8.35%）的分配比變化較?。▓D2）。

表3 兩種玉米幼苗莖葉中V 的亞細胞分布 Table 3 Subcellular distribution of V in shoots of two sweet maize varieties seedlings ω(Fresh)/(μg·g-1)

圖2 兩種玉米幼苗莖葉中V 的亞細胞分配比例 Fig. 2 Subcellular distribution proportion of V in shoots of two sweet maize varieties seedlings

2.4 不同脅迫時間對V 的亞細胞分布影響

在同一時間，隨著V 濃度增加，玉米幼苗根和莖葉中亞細胞各組分V 含量均增加，尤其根部增加顯著。在相同V 濃度處理下，隨著時間增加，不同品種玉米幼苗V 的亞細胞組分分配變化不同，V 處理質(zhì)量濃度為5 mg·L-1時，與4 d 比較，8 d 和12 d的益甜608 莖葉中，F(xiàn)1分配比分別下降了15.95%和24.13%，F(xiàn)4增加了14.11%和22.97%，根中F1比例增大了22.76%和49.81%，F(xiàn)4下降了4.96%和13.26%；美甜糯一號莖葉和根中，F(xiàn)1比例增加了18.19%和27.42%，5.01%和34.60%；F4比例下降了5.87%和7.96%，8.32%和28.88%。時間越長，植物根系中F1分配比增加越大，細胞壁對V 的沉積能力提高，成為V 的主要積累場所。

3 討論

3.1 玉米幼苗對V 的吸收積累和耐性

一些研究結果（Teng et al.，2013；Qian et al.，2014；Chongkid et al.，2007）表明，植物首先在根部富集V，再向地上部轉(zhuǎn)運，植物中V 濃度分布依次為：根＞葉片＞莖＞子粒。司江英等（2008）研究也表明，在添加Cu 的土培玉米植物中，Cu 濃度分布以根＞＞葉＞莖＞子粒的順序。本研究中，當用不同V 濃度處理，兩個品種玉米幼苗根部對V 的積累均遠大于莖葉部，根部分配比例高達約98%，這和前人的研究結果一致。顯然，玉米植株根部是存儲V的主要器官，玉米幼苗根部對V 的富集，可以降低V 在植物中的生物有效性，減少V 對地上部的毒害。從本研究時間動力學吸收特性來看，當V 脅迫時間較短（4 d），兩個品種玉米幼苗生長較好，吸收積累V 量相差不大；隨著時間增加，在不同V 濃度處理下，玉米幼苗根系和莖葉中V 含量均先增加后降低，這與李紅婷等（2015）研究結果一致。可能是隨著玉米植株培養(yǎng)時間增加，重金屬在玉米根細胞內(nèi)部和外部流速達到平衡，根系V 含量不再增加，使兩種玉米幼苗對V 的吸收在第8 天時達最大值。在V 處理后期，玉米幼苗莖葉有枯萎癥狀，這也影響植物對V 的吸收，導致植物中V 含量降低。兩個品種玉米各器官積累V 含量不同，表明不同品種玉米對V 的吸收機制不同。

植物的轉(zhuǎn)運系數(shù)（TF）指植物將金屬從根系到莖葉轉(zhuǎn)運的能力，TF 值越大，植物對金屬的轉(zhuǎn)運能力越強。在脅迫時間較短（4 d）時，隨著V 處理濃度增大，兩個品種玉米幼苗TF 值減小，而脅迫時間延長，TF 值則有所增大，但除對照外TF 值均小于0.1，表明玉米幼苗對V 的遷移能力較低，這就有利于將V 固持在根系，從而避免V 對植物莖葉部組織的損傷。程海寬等（2015）研究結果表明，不同品種玉米對Pb 的耐受性不同，Muhammad et al.（2018）研究兩種芥末基因型中，根系積累的V 都高于芽，而紫芥末對V 耐受性較高。同理，不同品種玉米對V 的吸收能力不同，其遷移能力和耐性也存在差異，當V 脅迫時間增加，美甜糯一號根系V含量比例增加達98.6%，而TF 值小于益甜608，表明對V 的耐性較好?？梢酝茰y玉米對V 的耐性機理為：外部適量V 不僅會誘導玉米幼苗體內(nèi)谷胱甘肽（GSH）和植物螯合素（PCs）的合成，而且細胞質(zhì)中的GSH 和PCs 能與V 生成穩(wěn)定硫肽復合物，降低其對植物的危害，而玉米根系比莖葉合成更多的GSH 和PCs，抵御V 的毒害作用大于莖葉，使玉米的耐性增強（Hou et al.，2019）。玉米植物能將吸收的V 隔離在植物根部，阻止其向地上部分運輸，不表現(xiàn)出明顯的中毒癥狀，所以玉米植物為耐受非超富集型植物（Sekhar et al.，2011）。

3.2 V 在兩種玉米幼苗中亞細胞分布

植物亞細胞組分中細胞壁的果膠、半纖維素和纖維素等大分子物質(zhì)能與重金屬結合將其固定（沈奕昕等，2018；Francine et al.，2014）。液泡是所有有毒物質(zhì)在植物體內(nèi)的終點站，轉(zhuǎn)運至液泡的重金屬與蘋果酸、檸檬酸、草酸等結合以及與非蛋白巰基（NPTs）等鰲合，實現(xiàn)金屬離子的區(qū)域化隔離，從而降低游離金屬離子的毒害（Pittman，2005；Brunetti et al.，2015）。本研究結果表明，在外源V的脅迫下，兩個品種玉米幼苗根系和莖葉中，細胞壁（F1）和細胞可溶性組分（F4）是植物V 積累的主要部位，二者比例之和根系達86%。莖葉部達87%，而進入細胞器的V 分配較少，表明玉米植株細胞壁V 的沉降和液泡區(qū)隔化作用是植物體內(nèi)部抵御V 脅迫的兩個重要過程。Fu et al.（2011）研究了美洲商陸對Cd 的耐性和解毒機制，在植物根和葉中Cd 主要位于可溶性部分和細胞壁中；Xu et al.（2018）研究發(fā)現(xiàn)，大豆幼苗根和葉中大約90%的Mo 在可溶性組分和細胞壁中積累，根富集的Mo 比葉片更高；楊素勤等（2015）研究結果表明，2 種小麥體內(nèi)Pb 主要存在于細胞壁和細胞液中，其合量占小麥體內(nèi)Pb 總量的72%—86%，本研究結果與前人相似。植物吸收的V 與細胞壁的多糖、蛋白質(zhì)等結合，這就限制了金屬的跨膜轉(zhuǎn)運，以便維持植物細胞正常的生理活動。當細胞壁的活性基團與V 結合達到飽和后，多余的金屬就會進入細胞內(nèi)，此時植物細胞內(nèi)的第二層保護機制被啟動，細胞內(nèi)分泌出的物質(zhì)如高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等可以將金屬區(qū)隔化而固定在液泡中，防止金屬傷害細胞器。玉米幼苗中V 還會與細胞質(zhì)中的非蛋白巰基如谷胱甘肽或植物螯合素結合，使V 的毒性進一步降低（Hou et al.，2019）。美甜糯一號玉米根部F1和F4分配比之和大于益甜608，更有利于對V 的解毒作用。隨著V 處理濃度的增加，兩個品種根系細胞壁（F1）分配比例增加，可溶性組分（F4）比例下降，但莖葉中兩組分比例變化不同，益甜608 的F1比例減小，F(xiàn)4比例增加，美甜糯一號的F1和F4變化相反。兩個品種玉米幼苗細胞內(nèi)細胞壁和可溶性組分分配比變化的此長彼消，是植物能夠抵抗過量V 毒害的主要機制。隨著V 脅迫時間延長，玉米根系F1的分配比例增加，表明植物根系細胞壁對V 沉積能力的提高，可以有效抑制V 向細胞器和地上部的轉(zhuǎn)移，避免了過量V 進入玉米莖葉組織，大大降低其毒性。V 在玉米根中的大量積累可能與植物體內(nèi)V 的亞細胞分布特征有很大關系。

唐杰等（2016）在研究不同水稻品種組織細胞中Cd 的轉(zhuǎn)運分配中發(fā)現(xiàn)，低積累水稻品種根系F1、F4等含量顯著高于高積累水稻品種；He et al.（2008）研究結果表明，在Cd 處理下，與野生型相比，突變型水稻植物生物量減少，可能是由于根系和葉片的細胞器分數(shù)中Cd 的分布較高，從而表現(xiàn)出更強的癥狀。這些結果說明同類植物品種不同表現(xiàn)出不同的耐性。益甜608 根細胞中的V 主要分配于細胞可溶部分（F4），而美甜糯一號則分布于細胞壁（F1），這可能與不同品種玉米幼苗對V 的耐性差異有關。要進一步闡明玉米對V 的解毒機制，還需結合超微結構的變化等深入研究。

4 結論

（1）兩個品種玉米幼苗根系V 含量顯著高于莖葉部，且具有較低的V 轉(zhuǎn)運能力（TF＜0.1），限制了V 在植物組織中的移動，避免了過量V 對玉米幼苗的傷害。玉米植物是V 的耐性植物。

（2）無論是在玉米幼苗根細胞或莖葉細胞中，V 主要富集在細胞壁（F1）和可溶性組分（F4），在細胞器中分配較少。隨著V 處理濃度和脅迫時間增加，細胞壁固持和液泡區(qū)隔化的相互協(xié)調(diào)，是玉米植物應對V 脅迫的主要耐性機制。

（3）不同品種玉米對V 具有不同的解毒機制，美甜糯一號主要依靠細胞壁的沉積作用，而益甜608 則是可溶性組分的區(qū)隔化作用。甜糯一號玉米根部吸收的V 更多位于細胞非生理活動區(qū)，植物對V 的耐性更好。