C57BL/6J、129/SvJ及其雜交一代小鼠的行為學比較研究

萬穎寒, 沈如凌, 王 玨, 龔 慧, 李 俊, 董 茹, 費 儉,2

(1. 上海實驗動物研究中心/同濟大學生命科學與技術學院模式生物技術聯(lián)合實驗室, 上海 201203；2. 上海南方模式生物科技股份有限公司 上海模式動物工程技術研究中心, 上海 201318)

小鼠是第一個實現(xiàn)轉基因和基因敲除的哺乳動物, 是人類疾病建模的首選模式生物[1]。近交系小鼠的基因高度純化，僅有不到1%的基因存在雜合性。利用近交系小鼠，人們已建立了大量與人類疾病相關的基因工程小鼠模型，極大地豐富了我們對人類基因功能和疾病發(fā)病機制的了解[2]。大部分基因工程小鼠是建立在某個特定近交品系的，基因工程小鼠的表型不僅來源于對靶基因的改造，還強烈地受到遺傳背景的影響，同一個基因突變在不同品系背景小鼠上可能出現(xiàn)不同的表型，其中也包括行為學表型[3,4]。所以了解不同近交系小鼠及其雜交后代的基本表型特征及差異對于解釋基因工程小鼠的表型研究結果是至關重要的。目前，構建和繁育基因工程小鼠常用的近交品系為C57BL/6J和129/SvJ。然而，對于C57BL/6J和129/SvJ及其雜交后代在行為上的差異尚缺少系統(tǒng)的比較研究。本文通過對近交系小鼠C57BL/6J、129/SvJ以及它們F1小鼠的行為研究, 了解不同背景小鼠的行為差異, 為解釋遺傳背景對基因工程小鼠行為學表型的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6J、129/SvJ及F1小鼠, 8～15周齡，均由上海南方模式生物科技股份有限公司提供[SCXK(滬)2014-0002]。所有動物實驗均在屏障設施 [SYXK(滬)2013-0035] 中完成，小鼠飼養(yǎng)在恒溫(21～22 ℃) 房間, 每隔 12 h 光暗循環(huán)(光照7∶00 am～19∶00 pm)。每日小鼠自由進食標準鼠糧及飲水。動物實驗方案獲得上海南方模式生物科技股份有限公司動物倫理委員會的批準(20140001, 20160008)。

1.2 主要試劑和儀器

曠場實驗、被動回避實驗儀器購自美國Kinder Scientific Company LLC公司； 水迷宮實驗、懸尾實驗、鼠博士動物行為學分析系統(tǒng)均購自上海移數(shù)信息科技有限公司；熱板儀器購自美國IITC Inc公司。

1.3 動物交配繁育

C57BL/6J(B6), 129/SvJ(129)小鼠同品系交配及品系間交配繁育得到雌雄兩種親代和F1代小鼠,每組小鼠需要交配繁育至少6籠, 以確保親代小鼠[B6(C57BL/6J♀×C57BL/6J♂)、129(129/SvJ♀×129/SvJ♂)、和F1代小鼠[129B6F1(129/SvJ♀×C57BL/6J♂)、B6129F1(C57BL/6J♀×129/SvJ♂)]♂♀比例及數(shù)量不少于12只。

1.4 行為學實驗

用于行為學實驗小鼠為8～15周齡、體質量20～25 g的成年小鼠，實驗前一周將小鼠轉移至實驗場所的IVC動物房飼養(yǎng), 使之適應新的環(huán)境。

小鼠的行為學實驗均在獨立安靜的房間內(nèi)進行, 測試和記錄的房間與操作人員的觀察房間分離。小鼠在實驗開始之前, 移入實驗環(huán)境，適應30 min。每個小鼠測試完成后，取走動物，清理儀器裝置中小鼠留下的尿液和糞便, 用體積分數(shù)75 %乙醇溶液擦拭小鼠接觸過的區(qū)域, 并用吸水紙擦去殘余乙醇，待乙醇揮發(fā)后再放入另一只小鼠進行測試, 保證小鼠之間不會因氣味相互影響。

行為學實驗選擇了針對焦慮、抑郁、學習記憶活動、熱痛等測定指標，實驗強度從低到高安排(圖1), 實驗之間確保小鼠得到充分休息。

1.4.1 曠場實驗 小鼠的運動具有趨壁性，天生害怕空曠場地，喜歡在邊緣和角落活動，因此曠場實驗利用一個大面積開放的區(qū)域作為刺激源使小鼠產(chǎn)生焦慮感，評價小鼠的探究行為、自主活動以及緊張度[5]。實驗在方形有機玻璃盒中進行，上方有日光燈照明,小鼠自由探索15 min。小鼠的運動軌跡由紅外探測記錄，傳輸至系統(tǒng)軟件分析(KS moter monitor)。

1.4.2 懸尾實驗 利用小鼠在尾巴被懸吊的短期、不可避免的壓力下，會形成一種不動的姿勢，來評估小鼠的抑郁程度[6]。使用醫(yī)用膠布將小鼠的尾巴吊在距桌面50 cm高的金屬環(huán)上。攝像頭記錄小鼠的活動。實驗持續(xù)時間為6 min, 0～2 min為適應時間, 分析統(tǒng)計2～6 min小鼠的不動時間。

1.4.3 水迷宮實驗 水迷宮是對嚙齒類動物空間學習的測試，它依靠遠端線索從開放游泳場所周邊的起始位置導航到水下逃生平臺，專門用來評估小鼠空間學習和記憶能力[7]。實驗參考文獻[8,9]設置，分7 d進行： 1 d為適應期，水中不設逃生平臺，池壁上不貼標記位置的白紙片，小鼠面朝池壁被放入水池中，自由游泳2 min。2～6 d為訓練期，在水中設逃生平臺，在池壁貼上標記位置的白紙片，平臺隱藏在水下1 cm處。每日每只小鼠分別從4個象限被放入水池中進行4次訓練。第7日為測試期，水中不設逃生平臺，池壁上保留標記，游泳1 min，上方攝像頭記錄小鼠游泳軌跡。

1.4.4 被動回避實驗 利用厭惡刺激來達到學習的目的, 評估嚙齒類動物的學習記憶能力[10,11]。實驗分3 d進行： 1 d為適應期，將小鼠放入明場令其探索30 s, 之后打開閘門, 讓小鼠在明暗場中自由探索，時間5 min。24 h進行訓練，將小鼠放入明箱中，30 s后打開閘門，觀察到小鼠四肢全部進入暗箱, 關閉閘門, 給予小鼠0.3 mA持續(xù)3 s的電流刺激，電流刺激過后30 s，拿出小鼠。48 h進行測試，將小鼠放入明箱，5s后打開閘門。小鼠的運動軌跡由紅外探測記錄，傳輸至系統(tǒng)軟件分析(KS moter monitor)。

1.4.5 熱板實驗 實驗在被均勻加熱的黑色陽極氧化鋁板上進行。IITC熱板鎮(zhèn)痛實驗用于小鼠的熱敏感潛伏期測試。打開熱板裝置，將熱板表面加熱至(55±0.2) ℃的恒溫。將小鼠放在熱板上，并被一個透明的丙烯酸保護套包圍，當測試的小鼠顯示舔后爪，輕拂或跳躍時，立即從熱板上取出小鼠并放回籠中，記錄時間[12]。

1.4.6 統(tǒng)計分析 采用Graphpad5.0軟件進行統(tǒng)計分析，使用ONE WAY ANVOA和TWO WAY ANVOA方法統(tǒng)計，并作圖。數(shù)據(jù)用±s表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義

2 結果

2.1 曠場實驗

圖2 雄性小鼠曠場活動表現(xiàn)

曠場實驗結果(圖2)顯示, 雄性組小鼠129相比于B6在邊緣活動的時間顯著增長(P＜0.001), 在中央?yún)^(qū)域的活動時間顯著減少(P＜0.001)。 129在中央?yún)^(qū)域與邊緣區(qū)域的運動路程比、運動時間比顯著低于B6(P＜0.001)。F1分別與129、B6比較，在邊緣活動的時間顯著低于129(P＜0.001)； 在中央?yún)^(qū)域活動時間顯著高于129(P＜0.001)； 在中央?yún)^(qū)域與邊緣區(qū)域的運動路程比、時間比顯著高于 129(P＜0.01)。

圖3顯示，雌性組小鼠129相比于B6在邊緣活動的時間顯著增長(P＜0.001)，在中央?yún)^(qū)域的活動時間顯著減少(P＜0.001)。129在中央?yún)^(qū)域與邊緣區(qū)域的運動路程比、運動時間比顯著低于B6(P＜0.001)。F1 分別與129、B6 比較, 在邊緣活動的時間顯著低于129(P＜0.001), 129B6F1顯著高于B6(P＜0.05)； 在中央?yún)^(qū)域活動時間顯著高于129(P＜0.001)，129B6F1 顯著低于 B6(P＜0.05)； 在中央?yún)^(qū)域與邊緣區(qū)域的運動路程比、時間比顯著高于129(P＜0.01), 129B6F1運動路程比、時間比顯著低于B6(P＜0.01,P＜0.05)。

2.2 小鼠懸尾實驗

結果顯示， 各實驗組不動時間差異均無統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 小鼠懸尾實驗抑郁樣指標

2.3 水迷宮實驗

圖3 雌性小鼠曠場活動表現(xiàn)

不同背景來源的雄鼠水迷宮結果(圖4)表明，隨著訓練時間增加， B6和129找到和爬上逃生平臺的潛伏期都會縮短，但差異未達到統(tǒng)計學意義。129B6F1和B6129F1找到和爬上逃生平臺的潛伏期都會顯著縮短(P＜0.01)。對各組小鼠的潛伏期曲線進行比較：B6比較129B6F1，在2～5 d均存在統(tǒng)計學差異(P＜0.01)； 129比較129B6F1，在4d、5d存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)； 129比較B6129F1，在5 d存在顯著性差異(P＜0.05)。B6129F1在原平臺所在象限的游泳時間顯著高于B6(P＜0.05)。

雌性小鼠結果(圖5)顯示, B6和129找到和爬上逃生平臺的潛伏期都會縮短, 且129在5 d顯著低于B6(P＜0.05)。129B6F1和B6129F1找到和爬上逃生平臺的潛伏期都會顯著縮短(P＜0.01)。對各組小鼠的潛伏期曲線進行比較：B6比較129B6F1和B6129F1，在5d均存在統(tǒng)計學差異(P＜0.005)。B6比較B6129F1, 在5d存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。B6129F1的穿越平臺次數(shù)顯著高于 B6(P＜0.05)。

2.4 被動回避實驗

從表2可見, 雄性組B6在3 d進入暗箱的潛伏期顯著低于129、B6129F1(P＜0.01)。雌性組B6在3 d進入暗箱的潛伏期顯著低于129(P＜0.001)。129B6F1和B6129F1在3 d進入暗箱的潛伏期顯著高于 B6(P＜0.001)。

各組小鼠在3 d測試期進入暗箱的時間顯著高于1 d、2 d訓練期(P＜0.001)，在訓練2 d小鼠電擊后進入暗箱的時間顯著低于1 d(P＜0.001)。

2.5 小鼠熱痛活動表現(xiàn)

B6在熱板上反應時間顯著低于129(P＜0.01)。雄性組小鼠129B6F1在熱板上的反應時間顯著低于129(P＜0.01)； B6129F1在熱板上的反應時間顯著高于 B6(P＜0.001)(圖 6)。

3 討論

我們利用一組行為實驗研究了B6、129以及它們的雜交后代小鼠的行為學表現(xiàn)。曠場活動中，129比B6表現(xiàn)出更高的焦慮水平，F(xiàn)1在曠場中表現(xiàn)偏向于B6；抑郁樣行為測試中，各小鼠組之間沒有統(tǒng)計學差異；在學習記憶測試中，129的學習記憶能力比B6強，而F1和129接近，在水迷宮則表現(xiàn)出更大的優(yōu)勢；熱板測試中，B6對熱痛比129更加敏感，在F1中，其行為主要由父系決定。

曠場實驗是廣泛用于評估嚙齒類動物焦慮樣狀態(tài)和測試抗焦慮藥物藥效的最常用測試手段[13]，測試是基于接近/回避沖突，動物表現(xiàn)出更愿意探索明亮、開放和升高的區(qū)域被認為“低焦慮水平”。本文結果表明, 129較B6表現(xiàn)更為焦慮, 這也與文獻報道[14,15]吻合。我們發(fā)現(xiàn)F1代在焦慮行為上主要受到B6的背景影響，在曠場實驗中F1代雄性小鼠與129之間存在統(tǒng)計學差異(P＜0.001),但和B6無顯著差異，因此B6背景更多地影響了F1在曠場環(huán)境下焦慮行為的表現(xiàn)，相對顯性。

圖4 雄性小鼠水迷宮表現(xiàn)

圖5 雌性小鼠水迷宮表現(xiàn)

表2 小鼠被動回避潛伏期 s

在學習記憶測試中，我們考察了小鼠在水迷宮和被動回避實驗的認知表現(xiàn)。認知和信息加工能力的評估是精神疾病機制研究和認知增強藥物臨床前研究的重要工具[16,17]。水迷宮實驗評估小鼠空間學習和記憶能力，是揭示海馬依賴性空間學習記憶能力改變的敏感方法[18]。被動回避實驗以電擊的方式給予小鼠一個厭惡刺激促使其違背先天的偏好，達到評估其學習能力的目的。被動回避是一種杏仁核依賴性測試，評估小鼠學習和保持聯(lián)想規(guī)則的能力。在水迷宮中B6和129行為表現(xiàn)沒有顯著性差異，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)在目標象限活動時間和穿臺次數(shù)上129表現(xiàn)出學習能力略優(yōu)于B6(P=0.06，P=0.07)，若增加樣本數(shù)，也許結果會有顯著性的差異。在被動回避實驗中，129對電刺激的敏感度和記憶能力顯著高于B6。F1表現(xiàn)出比兩種親代顯著優(yōu)異的空間學習記憶能力，但在被動回避表現(xiàn)上與129差異不顯著，因此在決定學習記憶方面，129背景影響相對顯性。

在熱痛敏感性測試中，雄性F1對熱敏感的行為特征和父代親本品系類似，表現(xiàn)出父系遺傳的特點，但該遺傳特征在雌性F1中沒有觀察到，而是表現(xiàn)為和129背景更接近。

圖6 小鼠熱板活動表現(xiàn)

小鼠的行為特征是深受品系背景影響的, 而年齡的差異也會對小鼠的行為產(chǎn)生不同的影響，造成數(shù)據(jù)的不一致，說明了表型和基因型之間的復雜關系。大規(guī)模行為測試數(shù)據(jù)分析表明, B6小鼠從成年到中年(2～3、4～5、6～7、8～12 月齡組)，在明暗箱、曠場活動、高架十字迷宮、爬桿、社交互動、預脈沖抑制、強迫游泳、懸尾實驗的各種行為表現(xiàn)中存在與年齡相關的變化[19]。我們曾經(jīng)研究過10周齡B6和129小鼠在水迷宮中的表現(xiàn)，結果發(fā)現(xiàn)B6的表現(xiàn)更好，和本次我們用的14周左右的小鼠的研究結果不一致[20]。

了解不同近交系小鼠的基本行為表現(xiàn)對于神經(jīng)系統(tǒng)基因及精神科疾病機制研究尤為重要。本文初步探討了B6、129以及其雜交后代F1的行為表現(xiàn), 為基因工程小鼠的表型研究提供了基礎數(shù)據(jù)。