膿腫分枝桿菌臨床分離株抗生素敏感性與基因型的關(guān)系

毛彥華 禇海青

上海市肺科醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200433

膿腫分枝桿菌是快速生長的非結(jié)核分枝桿菌，致病時可引發(fā)皮膚和軟組織感染，也可侵犯肺部，引起結(jié)核性肺病，易伴發(fā)醫(yī)源性感染甚至暴發(fā)流行[1]。近年來，隨著內(nèi)窺鏡、手術(shù)、移植、侵入性操作等增加及免疫功能障礙患者數(shù)量增多，膿腫分枝桿菌感染的發(fā)病率迅速上升[2]。國外研究報道顯示，膿腫分枝桿菌以韓國較為常見[3]。國內(nèi)相關(guān)研究顯示，我國南方地區(qū)膿腫分枝桿菌的檢出率較高[4]。陳華等[5]研究顯示，膿腫分枝桿菌檢出率為48.59%；潘建華等[6]研究顯示，膿腫分枝桿菌的檢出率為21.68%，且非結(jié)核分枝桿菌均具有較高的耐藥性。二者研究檢出率差異較大，主要考慮潘建華等[6]樣本量較大且時間跨度較長。膿腫分枝桿菌對多數(shù)一線抗生素耐藥，對抗結(jié)核藥物自然耐藥，長期聯(lián)合應(yīng)用抗生素治療也常效果欠佳[7]，多根據(jù)藥敏試驗結(jié)果進行抗生素的選擇。2007年美國胸科協(xié)會指南建議將克拉霉素（CLA）納入膿腫分枝桿菌的治療，但CLA 效力與細菌的基因型密切相關(guān)，其他感染性膿腫分枝桿菌的基因鑒別對抗菌藥物的選擇有重要意義[8]。本研究探討了上海市肺科醫(yī)院（以下簡稱“我院”）常用抗生素敏感性與膿腫枝桿菌基因型之間的關(guān)系?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年1月～2018年9月我院分離出的膿腫分枝桿菌分離株87株進行研究。納入標(biāo)準：臨床診斷明確，病歷資料完整。排除標(biāo)準：①準備或已納入其他臨床研究；②入組前3個月內(nèi)應(yīng)用抗生素；③合并嚴重惡性疾病、精神狀態(tài)異常。其中痰標(biāo)本72株，支氣管肺泡灌洗液15株，所有菌株均經(jīng)MGIT960培養(yǎng)基生長和對硝基苯甲酸試驗鑒定為非結(jié)核分枝桿菌，通過對rPOB 基因測序進一步鑒定為膿腫分枝桿菌。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準通過，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

BACTECMGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)儀（美國BD 公司），7500型PCR 擴增儀（美國ABI 公司），Extractor36型核酸提取儀（中國博奧生物有限公司）、基因微陣列芯片雜交盒和PCR 擴增反應(yīng)試劑盒（中國博奧生物有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取 取10 μL 細菌轉(zhuǎn)移到含有TE 緩沖液和玻璃珠的微離心管中，渦旋后，1份樣品與溶菌酶在37℃下孵育過夜。后加入十二烷基硫酸鈉和蛋白酶K，在65℃下繼續(xù)孵育20 min。再加入10%N-乙酰基N,N,N-三甲基溴化銨和0.7 mol/L 氯化鈉以及0.5 mol/L 氯化鈉。將混合物在65℃下孵育20 min 后，加入氯仿-異戊醇（24∶1），常溫下12 000 r/min 離心10 min，離心半徑8 cm。剩余的水相中DNA 用異丙醇沉淀，13 000 r/min 離心10 min 收集。用乙醇沉淀洗滌，溶解于Te 緩沖液中，使用NanoDrop2000超微量分光光度計對基因組DNA 進行定量，用高質(zhì)量DNA樣品構(gòu)建350～450 bp 的片段文庫。使用來自每個菌株的純化基因組DNA 構(gòu)建測序文庫，按照Illumina標(biāo)準基因組DNA 文庫制備方案制備插入程度約為400 bp 的配對端文庫，使用Covaris 聚集超聲儀將純化的基因組DNA 剪切成較小的片段，用T4DNA 聚合酶產(chǎn)生鈍端，在3′末端添加A 堿基后，將適配器連接到鈍化的磷酸化DNA 片段的每個末端，片段經(jīng)凝膠電源純化，PCR 擴增，在PCR 過程中，將索引標(biāo)簽引入到適配器中，并進行庫質(zhì)量測試。將符合條件的ILITA配對末端文庫用于Illumina HISEQ 測序（150 bp×2）。SPAdes 與Bayeshammer 組合糾正序列組錯誤，然后用SPAdes 的默認參數(shù)組裝基因組，使用QuAST 評估組裝結(jié)果。采用NCBI Nucleotide blast program 進行SNP 分析，選擇M.膿腫標(biāo)準菌株ATCC19977作為rrl 和ERM（41）T28的參考菌株，選擇CR5701（HQ127366.1）作為ERM（41）C28的參考菌株，選擇CCUG48898（AP014547.1）作為M 型的參考菌株。

1.3.2 藥敏試驗 采用微量稀釋法[9]測定抗生素敏感性，測試我院常用治療膿腫分枝桿菌抗生素的敏感性，包括磺胺類（SXT）、莫西沙星（MXF）、頭孢西?。‵OX）、阿米卡星（AMI）、強力霉素（DOX）、替加環(huán)素（TGC）、克拉霉素（CLA）、利奈唑胺（LZD）、亞胺培南（IMI）和妥布霉素（TOB）。在膿腫分枝桿菌復(fù)合群鑒定后3 d（ERT）、14 d（LRT）評估敏感性，敏感菌株最低抑菌濃度（MIC）≤2 mg/L，中間MIC=4 mg/L，獲得性耐藥菌株MIC≥8 mg/L，誘導(dǎo)性耐藥菌株在ERT時MIC≤4 mg/L，LRT 時MIC≥8 mg/L，以金黃色葡萄球菌為對照品系[10-13]。

2 結(jié)果

2.1 膿腫分枝桿菌分離株藥敏性

87株分離種包括81個subsp.abscessus 和6個subsp.massiliense，81個subsp.abscessus 共72個ERM（41）T28序列和9個ERM（41）C28序列，ERM（41）序列對10種抗生素的敏感性。見表1。

2.2 膿腫分枝菌對CLA 敏感性

81個subsp.abscessu 亞型中包括41個CLA 敏感株和10個CLA 中介株，8個ERM（41）C28和43個ERM（41）T28分離株不存在rrl 2058/2059突變，30個耐藥分離株中包括29個ERM（41）T28分離株（其中5個發(fā)生rrl 2058/2059突變）和1個ERM（41）C28分離株（1個發(fā)生rrl 2058/2059突變）。Subsp.massiliense耐藥分離株2個，1個發(fā)生rrl 2058/2059突變。見表2。

表1 膿腫分枝桿菌分離株的抗生素敏感性

3 討論

研究顯示，膿腫分枝桿菌23S rRNA（RRL）基因2058/2059（大腸埃希菌編號）位點的點突變可導(dǎo)致獲得性CLA 抗性，完整的ERM（41）基因第28核苷酸處顯示為T/C 多態(tài)性。當(dāng)胸腺嘧啶為核苷酸時，CLA 誘導(dǎo)的ERM（41）T28基因產(chǎn)物甲基化核糖體23S mRNA可防止CLA 與核糖體結(jié)合，表現(xiàn)為CLA 抗性。當(dāng)ERM（41）基因第28核苷酸是胞苷時，則CLA 抗性喪失[14-16]。因此，膿腫分枝桿菌抗生素敏感性研究多集中于ERM（41）和2058/2059 rrl 基因突變。

表2 膿腫分枝菌對CLA 敏感性（例）

國外研究[17-18]顯示，膿腫分枝桿菌CLA 耐藥性比例為2.51%（美國）～15.84%（韓國）。本研究結(jié)果顯示，ERT 評估膿腫分枝桿菌耐藥性的比例為36.78%，高于國外研究結(jié)果，考慮與各國人口基線的不均衡性、抗生素管理和臨床應(yīng)用差異等因素有關(guān)。進一步分析顯示，subsp.abscessu 亞型中僅有6例有2058/2059 rrl 突變，其他24個分離株中未檢測到2058/2059 rrl 突變。未檢測到2058/2059 rrl 突變的24個分離株屬于ERM（41）T28，進一步分析可知，24株分離株患者分離前有22株曾用過大環(huán)內(nèi)酯類藥物，既往有大環(huán)內(nèi)酯類藥物應(yīng)用史可能是導(dǎo)致CLA 耐藥性的重要原因。在subsp.massiliense 亞型中分離出的2株CLA 抗性株中，僅1例具有2058/2059 rrl 突變，因為subsp.massiliense 具備不完全/分功能性ERM（41），無2058/2059 rrl 突變株CLA 耐藥機制有待進一步研究探討。有研究[19]顯示，長期接觸CLA 可導(dǎo)致50S核糖體亞基結(jié)構(gòu)改變，暴露后多數(shù)患者出現(xiàn)2058/2059 rrl 突變，但有2.5%的rpⅣ基因有18 bp 插入突變，編碼L22核糖體蛋白。本研究未發(fā)生2058/2059 rrl突變的CLA 抗性菌株中未發(fā)現(xiàn)rpⅣ突變。

AMI 也是治療膿腫分枝桿菌的常用藥物。研究[20]顯示，AMI 耐藥的潛在機制是rrs 基因核苷酸1408的A-G 突變。本研究僅有1株檢測出AMI 抗性，且未檢測到rrs 1408突變。本研究認為AMI 治療本地區(qū)膿腫分枝桿菌似乎優(yōu)于CLA，其有效性值得進一步研究探討。本研究中，其他抗生素均未檢測到耐藥相關(guān)基因型。綜上所述，rrl 和ERM（41）基因型對膿腫分離桿菌臨床分離株CLA 耐藥具有一定預(yù)測作用，AMI 治療膿腫分枝桿菌可能具有更佳效果，值得進一步研究探討。

本研究不足之處及下一步研究方向：本研究納入樣本量相對較少，且缺乏膿腫分枝桿菌臨床分離株抗生素敏感性與基因型關(guān)系的探討。在日后的研究中應(yīng)進一步擴大樣本量，采用大樣本、多中心分析二者關(guān)系以進一步論證本文研究結(jié)果。