復(fù)方血竭微乳體外透皮吸收及抗炎活性研究

黨學(xué)良 賈麗華 宋彥峰 趙 軍 王慶偉

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，陜西西安 710038；2.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安 710065

復(fù)方血竭微乳由血竭、當(dāng)歸、川芎、肉桂4味藥材組成，具有去腐生肌、促進(jìn)局部血液循環(huán)和抑菌等功效，可用于治療燒傷及其他化學(xué)物質(zhì)引起的皮膚損傷[1]。本文選用復(fù)方血竭微乳中當(dāng)歸和川芎的主要有效成分藁本內(nèi)酯作為透皮吸收的檢測指標(biāo)[2-3]，采用改良Franz 擴(kuò)散池法進(jìn)行體外透皮滲透性實(shí)驗(yàn)，考察不同濃度復(fù)方血竭微乳的透皮效果，利用足跖腫脹動(dòng)物模型考察其抗炎作用，為復(fù)方血竭微乳的深入研究提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與試藥

Agilent 1100液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Franz TT-6透皮吸收儀（河南鞏義予華實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；電子天平（精密度十萬分之一，德國賽多利斯公司）；YSL-7A 足容積測量儀（山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站）。復(fù)方血竭微乳（空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科制備，含復(fù)方提取物藥量分別為1.0%、2.5%、5.0%）；藁本內(nèi)酯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111737-201305）；乙腈（美國TEDIA 公司，色譜純）；其余試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級雄性SD 大鼠64只，體重200～220 g，合格證號：37009200001779。購自空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號：SCXK（軍）2014-007]。自由飲水?dāng)z食，室溫保持在（23±2）℃。所有實(shí)驗(yàn)方案都獲得了空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會的批準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱：InertsilODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈∶水=62∶38（V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：A280 nm；柱溫：25.0℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2 對照品儲備液的制備 精密稱定藁本內(nèi)酯對照品10.61 mg，置10 mL 棕色容量瓶中，用無水乙醇溶解，定容，搖勻，制備成對照品儲備液，冷藏避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 對照品溶液的制備 精密量取藁本內(nèi)酯對照品儲備液適量，用30%乙醇-生理鹽水逐步稀釋成10.08 μg/mL 的藁本內(nèi)酯對照品溶液。

2.1.4 供試品溶液的制備 改良Franz 擴(kuò)散池有效滲透面積0.785 cm2，接收池容積為15.0 mL，水浴循環(huán)溫度（37±0.5）℃，接收池內(nèi)300 r/min 恒速攪拌。實(shí)驗(yàn)時(shí)將制備好的離體大鼠皮膚平鋪在接收池口上，角質(zhì)層面向上，然后將供藥池用夾子固定在接收池上。通過取樣管將30%乙醇-生理鹽水接收液注入接收池內(nèi)，排凈空氣。體系溫度恒定后，將5.0%的復(fù)方血竭微乳2 mL 加入供藥池內(nèi)密封。打開磁力攪拌器，定速攪拌并開始記時(shí)，24 h 后從取樣管抽取接收液1.0 mL為供試品溶液。

2.1.5 專屬性 分別取藁本內(nèi)酯對照品溶液和供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下條件分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，見圖1?？疾旆椒ㄉV系統(tǒng)適用性，在該條件下，藁本內(nèi)酯色譜峰基線完全分離，保留時(shí)間為8.7 min（圖1A），透皮接收液中的其他成分（圖1B）對藁本內(nèi)酯的測定無干擾。

2.1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密量取藁本內(nèi)酯對照品儲備液適量，用30%乙醇-生理鹽水逐步稀釋成0.2015、1.0080、2.1020、10.0800、20.1600、30.2400、40.1500 μg/mL的藁本內(nèi)酯對照品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以藁本內(nèi)酯對照品的濃度（C）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=11.93C+2.85（r=0.9997）。表明藁本內(nèi)酯在0.2015～40.1500 μg/mL范圍內(nèi)，具有良好線性關(guān)系。

圖1 藁本內(nèi)酯對照品及供試品溶液色譜圖

2.1.7 精密度 取藁本內(nèi)酯對照品儲備液適量，用30%乙醇-生理鹽水溶液稀釋成0.2015、10.0800、40.1500 μg/mL藁本內(nèi)酯對照品溶液同日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，測得峰面積RSD 分別為1.81%、1.49%、0.73%。

2.1.8 重復(fù)性 取同一時(shí)間點(diǎn)的供試品溶液，平行6份，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積，以藁本內(nèi)酯峰面積的RSD 評價(jià)重復(fù)性。其重復(fù)性RSD≤2.0%，重復(fù)性良好。

2.1.9 穩(wěn)定性 取供試品溶液，在室溫下分別放置0、2、4、8、12 h，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定，計(jì)算RSD 為1.11%，表明在該實(shí)驗(yàn)條件下，樣品在12 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.1.10 回收率 取同一批5%復(fù)方血竭微乳（藁本內(nèi)酯含量為20.65 μg/mL）24 h 透皮吸收接收液9份，分成藁本內(nèi)酯低、中、高濃度組，每組3份，分別加入20.16 μg/mL的藁本內(nèi)酯30%乙醇-生理鹽水對照品溶液0.1、1.0、3.0 mL。用30%乙醇-生理鹽水定溶至5 mL 量瓶中，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算得藁本內(nèi)酯低、中、高濃度組的平均加樣回收率分別為101.4%、100.1%、99.86%；RSD 分別為1.67%、1.22%、0.26%。見表1。

表1 樣品中藁本內(nèi)酯加樣回收率

2.2 透皮吸收實(shí)驗(yàn)

2.2.1 離體大鼠皮膚的制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后，腹腔注射30 %水合氯醛麻醉，脫頸處死，用剃毛器剔除腹部皮膚鼠毛，再仔細(xì)去除短毛，用手術(shù)剪剝?nèi)∑つw，除去皮下脂肪層，用生理鹽水沖洗數(shù)次，濾紙吸干皮膚表面生理鹽水，解剖鏡下選取適當(dāng)大小未損傷的皮膚備用[4-5]。

2.2.2 體外透皮吸收實(shí)驗(yàn) 改良Franz 擴(kuò)散池有效滲透面積0.785 cm2，接收池容積為15.0 mL，水浴循環(huán)溫度（37±0.5）℃，接收池內(nèi)300 r/min 恒速攪拌。實(shí)驗(yàn)時(shí)，取SD 大鼠24只，按隨機(jī)數(shù)字表法將其分為3組，分別為復(fù)方血竭微乳低劑量組（1.0%）、復(fù)方血竭微乳中劑量組（2.5%）、復(fù)方血竭微乳高劑量組（5.0%），每組8只。分別取不同組大鼠同一部位完整皮膚置于預(yù)先放有攪拌子的水平擴(kuò)散池的結(jié)合部、角質(zhì)層面朝上，夾緊密封。通過取樣管將30%乙醇-生理鹽水接收液注入接收池內(nèi)，排凈空氣[6-7]。待體系溫度恒定后，分別將復(fù)方血竭微乳低、中、高三種濃度的藥物各2 mL 加入供藥池內(nèi)密封。磁力攪拌器定速攪拌并計(jì)時(shí)，分別在開始后2、4、6、9、12、18、24 h 從取樣管抽取接收液1.0 mL，同時(shí)補(bǔ)加1.0 mL 已37℃預(yù)熱好的新鮮接收液，排凈氣泡[8-10]。

采集的樣品經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后進(jìn)行HPLC 測定，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算藁本內(nèi)酯的濃度，并按下式計(jì)算單位面積累計(jì)透過量（Qn）。

公式中Cn為第n 個(gè)取樣點(diǎn)測得的藥物濃度（μg/mL）；V 為接收液體積（15 mL）；Ci為第i 個(gè)取樣點(diǎn)測得的藥物濃度（μg/mL）；Vi為取樣體積（1.0 mL）；A 為滲透面積（0.785 cm2）。

將累積滲透量Qn對時(shí)間t 進(jìn)行線性回歸，所得Qn-t 方程即為Higuchi 方程，其斜率即為藁本內(nèi)酯的透皮速率常數(shù)Jss[μg/（cm2·h）]。

2.3 角叉菜膠致大鼠足跖腫脹實(shí)驗(yàn)

SD 大鼠40只，按體重隨機(jī)分為5組，即模型組、醋酸地塞米松乳膏組（陽性對照組，100 mg/kg）、復(fù)方血竭微乳高劑量組（5.0%）、復(fù)方血竭微乳中劑量組（2.5%）、復(fù)方血竭微乳低劑量組（1.0%），每組8只。實(shí)驗(yàn)前采用足容積測量儀測定各組正常大鼠右后足跖的體積，作為致炎前的足跖體積[11]，給藥組每天分別涂抹相應(yīng)的藥物1次，給藥后適當(dāng)按摩促進(jìn)吸收，模型組涂抹蒸餾水，連續(xù)3 d。于第3天給藥后60 min，每只大鼠右后足注射1.0%角叉菜膠0.1 mL。分別測量致炎后1、2 h 及3 h 大鼠右后足跖容積[12-16]，計(jì)算足跖腫脹率。足跖腫脹率（%）=（腫脹后各時(shí)間點(diǎn)足容積－原始足容積）/原始足容積×100%

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

首先運(yùn)用球形檢驗(yàn)判斷重復(fù)測量數(shù)據(jù)右后足跖容積在各時(shí)間點(diǎn)之間是否存在相關(guān)性，如果該檢驗(yàn)P ＞0.05，說明重復(fù)測量數(shù)據(jù)之間實(shí)際上不存在相關(guān)性，數(shù)據(jù)符合Huynh-Feldt 條件，可按單因素方差分析方法來處理；如果P ＜0.05，說明重復(fù)測量數(shù)據(jù)之間存在相關(guān)性，不可按單因素方差分析方法處理。

2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 透皮吸收結(jié)果 低、中、高劑量組的復(fù)方血竭微乳主要活性成分藁本內(nèi)酯皮膚滲透行為均符合Higuchi方程。低、中、高劑量組的復(fù)方血竭微乳主要活性成分藁本內(nèi)酯在24 h 內(nèi)的累積透過量分別為（153.000±6.586）、（311.200±14.520）、（454.100±23.440）μg/cm2累積滲透量Qn與時(shí)間t 呈良好線性關(guān)系，r 值均大于0.9，單位面積累積透過量在2～24 h 之間呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性。說明復(fù)方血竭微乳具有良好的體外釋放和透皮性能，24 h 內(nèi)單位面積累積透過量隨藥物中主要有效成分藁本內(nèi)酯含量增高而增大，經(jīng)皮滲透行為符合零級動(dòng)力學(xué)方程。見表2、圖2。

圖2 三種濃度復(fù)方血竭微乳中藁本內(nèi)酯大鼠皮膚的單位面積累積透過曲線

表2 藁本內(nèi)酯大鼠皮膚滲透動(dòng)力學(xué)參數(shù)（n=5）

2.5.2 對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹影響 整體分析發(fā)現(xiàn)：組間比較、時(shí)間點(diǎn)比較及交互作用差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。提示復(fù)方血竭微乳低、中、高劑量組能顯著抑制角叉菜膠致大鼠足跖腫脹。復(fù)方血竭微乳低劑量組足跖腫脹率與模型組在致炎后1 h 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），其余各組分別在不同時(shí)間點(diǎn)足跖腫脹率與模型組比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；致炎后1～3 h，隨著時(shí)間延長，復(fù)方血竭微乳各劑量組足跖腫脹率逐漸降低，且致炎后2 h及3 h足跖腫脹率均低于致炎后1 h（P ＜0.05）；致炎后3 h 足跖腫脹率低于致炎后2 h（P ＜0.05）。

3 討論

藁本內(nèi)酯（ligustilide，又名東當(dāng)歸內(nèi)酯）在化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于苯酞類化合物，存在于多種傘形科植物中，其中當(dāng)歸、川芎中的藁本內(nèi)酯含量較高[17]。屬于揮發(fā)油成分的藁本內(nèi)酯易溶于乙醇、乙醚、乙酸乙酯、甲醇和石油醚等有機(jī)溶劑[18]，其含有不飽和苯酞結(jié)構(gòu)，化學(xué)結(jié)構(gòu)較不穩(wěn)定。因此，為了兼顧溶解性和人體環(huán)境相似性，透皮接收液選擇30%乙醇-生理鹽水。

本研究采用改良Franz 擴(kuò)散池，以大鼠皮膚作為體外透皮吸收皮膚，分別以滿足漏槽條件的親水和親脂性溶液作為釋放液，采用HPLC 法測定滲透液中藁本內(nèi)酯濃度。高、中、低三種不同濃度的復(fù)方血竭微乳，24 h 內(nèi)單位面積累積透過量隨藥物中主要有效成分藁本內(nèi)酯含量增高而增大。在藥物透皮實(shí)驗(yàn)過程中，為防止大鼠皮膚中含有的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子在接收液中溶出而影響檢測結(jié)果，因此在皮膚制備時(shí)要除掉多余的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)物質(zhì)，并在進(jìn)行HPLC 法檢測之前必須對接收液用濾膜進(jìn)行過濾，以排除干擾，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表3 復(fù)方血竭微乳對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響（）

表3 復(fù)方血竭微乳對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響（）

注：與模型組同期比較，*P ＜0.05；**P ＜0.01；與本組1 h 比較，#P ＜0.05；與本組2 h 比較，△P＜0.05

藁本內(nèi)酯作為當(dāng)歸、川芎的主要有效成分，前期研究表明，藁本內(nèi)酯具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)保護(hù)、抗癌、抑制心肌肥大、抗炎、鎮(zhèn)痛等廣泛的藥理活性[19-21]。本實(shí)驗(yàn)通過建立角叉菜膠致大鼠右后足跖腫脹模型來研究復(fù)方血竭微乳抗炎作用，研究表明復(fù)方血竭微乳有較好的抗炎活性。目前本課題組正在采用二甲苯致小鼠耳腫脹、醋酸扭體等模型多角度進(jìn)行抗炎作用研究，為其臨床應(yīng)用奠定良好的研究基礎(chǔ)。