急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠中IL-17和NF-κB 的表達(dá)和意義

沈瑞明 鐘良寶 鄭顏萍 梁海琴

海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎病風(fēng)濕科，海南海口 570102

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（acute gouty arthritis，AGA）是尿酸鹽沉積關(guān)節(jié)而引起的一種強(qiáng)烈的急性炎性反應(yīng)，然而其確切機(jī)制尚未完全明了。其中，炎性反應(yīng)中有諸多機(jī)制參與該過程，研究表明，白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素18（interleukin-18，IL-18）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）等炎癥因子參與了痛風(fēng)的進(jìn)程，且它們之間相互作用、相互促進(jìn)[1-2]。白細(xì)胞介素17（interleukin-17，IL-17）主要由輔助性T 細(xì)胞17（T helper cell 17，Th17）產(chǎn)生，參與先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，與多種自身免疫病的發(fā)病有關(guān)[3-4]。迄今為止，對(duì)IL-17在AGA 中的作用知之甚少。近期的研究表明，先天免疫參與了痛風(fēng)的發(fā)病，痛風(fēng)患者血清IL-17表達(dá)水平明顯升高[5-6]。研究表明，核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）是炎癥、免疫等細(xì)胞反應(yīng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)眾多的細(xì)胞因子的表達(dá)。NF-κB 是許多炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的樞紐[7]。IL-17與NF-κB 在AGA 中的表達(dá)尚鮮見報(bào)道。本研究通過建立AGA 模型，研究IL-17、NF-κB等在AGA 患者血清中的表達(dá)，從而探討兩者在AGA 中作用機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠，質(zhì)量（200±20）g，由海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：HNXK（瓊）2017-0018。

1.2 主要儀器與試劑

尿酸鈉購自美國(guó)Sigma 公司，其他試劑均為分析純。p-NF-κB p65抗體購于美國(guó)Abcam 公司，大鼠IL-1β、IL-17及TNF-α 試劑盒均為美國(guó)R&D 公司進(jìn)口分裝酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)試劑盒。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理

1.3.1 動(dòng)物分組 45只SD 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（9只）和模型組（36只），模型組分為4個(gè)亞組：6、12、24 h 及72 h，每組9只。

1.3.2 造模 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，AGA 大鼠模型造模方法參照Coderre[8]方法制作，對(duì)照組注射等體積生理鹽水。造模后各組大鼠右后踝關(guān)節(jié)均出現(xiàn)腫脹，造模成功。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 一般情況觀察 觀察大鼠造模前后活動(dòng)、進(jìn)食、精神情況、體重、步態(tài)等情況。

1.4.2 各組大鼠血清炎癥因子測(cè)定 造模后于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，用3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹靜脈取血4～6 mL，室溫靜置25 min 后置3500 r/min離心機(jī)離心10 min，用吸液管取上清液，ELISA 法測(cè)定IL-1β、IL-17及TNF-α 水平。

1.4.3 各組大鼠滑膜組織炎癥因子測(cè)定 造模后于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，過量麻醉處死各組大鼠，置于有冰塊的干燥托盤內(nèi)快速分離出右踝關(guān)節(jié)及周圍軟組織，切取滑膜組織，制成勻漿，4℃下8000 r/min 離心5 min 后取上清液，ELISΑ 法測(cè)定IL-1β、IL-17及TNF-α 水平。

1.4.4 蛋白印跡法（Western blot）檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB 的表達(dá) 過量麻醉處死大鼠，取受試關(guān)節(jié)上下5 mm 的滑膜組織，置于冰上勻漿，按照說操作明書提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，Western blot 檢測(cè)滑膜組織中p-NF-κB 的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)；以P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

45只大鼠均進(jìn)入結(jié)果分析，造模后大鼠煩躁，右后踝關(guān)節(jié)明顯紅腫、活動(dòng)受限，對(duì)照組無煩躁等表現(xiàn)，右后踝關(guān)節(jié)較造模前相比略有增粗，72 h 后模型組大鼠煩躁、關(guān)節(jié)紅腫、活動(dòng)受限明顯減輕。

2.2 AGA 大鼠血清及滑膜中的炎癥因子變化

模型組血清和滑膜中IL-1β、IL-17及TNF-α 的水平均明顯高于正常對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.01）。模型組中，6 h 后隨時(shí)間的變化，大鼠血清和滑膜中IL-1β、IL-17及TNF-α 的水平逐漸下降（P <0.01）。見表1～2。

表1 各組大鼠血清中各炎癥因子水平的比較（ng/L，，n=9）

表1 各組大鼠血清中各炎癥因子水平的比較（ng/L，，n=9）

注：與對(duì)照組比較，*P <0.01。IL-1β：白細(xì)胞介素1β；IL-17：白細(xì)胞介素17；TNF-α：腫瘤壞死因子-α

表2 各組大鼠滑膜中各炎癥因子水平的比較（ng/L，，n=9）

表2 各組大鼠滑膜中各炎癥因子水平的比較（ng/L，，n=9）

注：與對(duì)照組比較，*P <0.01。IL-1β：白細(xì)胞介素1β；IL-17：白細(xì)胞介素17；TNF-α：腫瘤壞死因子-α

2.3 關(guān)節(jié)滑膜組織中p-NF-κB p65的表達(dá)

造模后6 h，p-NF-κB p65的表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高（P <0.01），12 h 其表達(dá)量達(dá)到頂峰，但在造模后24 h 開始下降，72 h 表達(dá)量顯著下降，但仍高于正常；造模后12 h，p-NF-κB p65的表達(dá)量顯著高于6 h（P <0.01），24 h 后其表達(dá)量明顯低于12 h（P <0.01），72 h 后其表達(dá)量顯著低于24 h（P <0.01）。見圖1。

圖1 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中p-NF-κB p65的表達(dá)

3 討論

痛風(fēng)是由關(guān)節(jié)和軟組織中的尿酸單鈉（MSU）晶體沉積誘發(fā)的具有自限性和劇烈疼痛等特點(diǎn)的炎癥性疾病，可導(dǎo)致急性或慢性關(guān)節(jié)炎。目前，普遍認(rèn)為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎主要是由中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，尿酸鹽晶體能夠引發(fā)白細(xì)胞和滑膜細(xì)胞的炎性反應(yīng)，觸發(fā)細(xì)胞因子和其他炎癥介質(zhì)的釋放，從而吸引更多的中性粒細(xì)胞聚集，吞噬結(jié)晶的中性粒細(xì)胞釋放溶酶體酶，導(dǎo)致組織損傷，從而放大局部炎性反應(yīng)[9]。MSU 晶體是炎癥的有效誘導(dǎo)劑，可以引發(fā)、放大和維持強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)[6,10]。然而，這些晶體引發(fā)急性炎癥的機(jī)制尚不清楚。

IL-17是具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，參與了體內(nèi)大量的炎性反應(yīng)，在炎癥性疾病的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[11-12]。NF-κB 是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，調(diào)控體內(nèi)誘導(dǎo)趨化因子、細(xì)胞因子、補(bǔ)體等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄[13]。近年來，NF-κB 信號(hào)通路被認(rèn)為與AGA 的發(fā)病及炎性反應(yīng)密切相關(guān)[14]。NF-κB 參與了調(diào)控AGA 重要細(xì)胞因子的表達(dá)，這些細(xì)胞因子對(duì)免疫細(xì)胞的活化、增殖、浸潤(rùn)、趨化和分泌起著直接的調(diào)控作用[15]。在AGA 時(shí)，活化的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)靶基因并促使靶基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)IL-1β、IL-18、TNF-α等細(xì)胞因子的分泌，IL-1β、IL-18、IL-23等相互作用，促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，從而產(chǎn)生增強(qiáng)局部炎癥的IL-17[16]。相關(guān)性分析表明IL-17表達(dá)不僅與AGA 活動(dòng)呈正相關(guān)，而且與IL-1β 的血清水平相關(guān)[12]。既往研究認(rèn)為，IL-1β 被認(rèn)為是AGA 調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因素[17-18]。近期的研究表明，IL-1β 在IL-17-γδT 細(xì)胞向IL-17+γδT 細(xì)胞的分化中起了重要的作用，IL-17可能是IL-1β 的下游促炎細(xì)胞因子[3,19]，它可作為AGA 的生物標(biāo)志物之一。

本研究結(jié)果表明，大鼠在AGA 造模后，精神、進(jìn)食、活動(dòng)明顯減少，右后踝關(guān)節(jié)腫脹、活動(dòng)受限，隨時(shí)間的變化，其精神、活動(dòng)逐漸改善，踝關(guān)節(jié)腫脹逐漸減輕。與對(duì)照組比較，造模后6 h，大鼠血清及滑膜中IL-1β、IL-17及TNF-α 表達(dá)明顯增高，12 h 達(dá)頂峰，24 h 逐漸降低。表明大鼠關(guān)節(jié)腔注射尿酸鈉后，迅速誘發(fā)關(guān)節(jié)及周圍組織的炎性反應(yīng)，激活I(lǐng)L-1β 促使趨化因子、炎性因子等細(xì)胞因子發(fā)揮促炎作用，導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞分化、中性粒細(xì)胞釋放、炎癥復(fù)合體活化等，T 細(xì)胞分化產(chǎn)生IL-17，誘發(fā)痛風(fēng)急性炎癥[20]；此外，IL-1β 可激活破骨細(xì)胞使其分化，并作用于神經(jīng)元，觸發(fā)機(jī)體對(duì)炎癥所致疼痛反應(yīng)的過度敏感[21]。而TNF-α 又能通過相關(guān)信號(hào)通路促使IL-1β、IL-17等細(xì)胞因子分泌，中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞出現(xiàn)吞噬活性并釋放氧自由基及蛋白水解酶，導(dǎo)致尿酸鹽沉積處出現(xiàn)充血、水腫，促使大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并不斷加重。同時(shí)，磷酸化NF-κB p65的表達(dá)水平在造模后6 h明顯增高，12 h 表達(dá)最高，24 h 逐漸下降，提示AGA 后，NF-κB 被激活，活化的NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核，完成相關(guān)炎性基因的轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)IL-17、IL-1β、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致AGA 炎性反應(yīng)發(fā)生，隨實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展，關(guān)節(jié)炎逐漸改善，炎癥逐漸減輕，p-NF-κB p65的表達(dá)水平逐漸下降，進(jìn)一步證實(shí)了NF-κB 信號(hào)通路與AGA 的發(fā)病密切相關(guān)。

綜上所述，AGA 后，IL-17與NF-κB 的表達(dá)先迅速增高，隨時(shí)間的變化，逐漸下降，兩者之間變化與AGA 過程密切相關(guān)。預(yù)示IL-17可能作為AGA 的一種新的生物標(biāo)志物，可用于AGA 的診斷與治療評(píng)估。盡管AGA 免疫機(jī)制尚未完全明了，然而痛風(fēng)急性炎癥過程中IL-17與NF-κB 之間的相互關(guān)系，為該病的治療提供了新思路和切入點(diǎn)。