陜產(chǎn)柿葉總黃酮磷脂復(fù)合物制備工藝研究

陳 吼

(楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100 )

柿葉為柿科植物柿DiospyroskakiThunb.的葉，華東、陜西、甘肅等地是其主要分布地，其中陜西為大宗產(chǎn)地。在傳統(tǒng)的應(yīng)用中以及現(xiàn)代的藥理學(xué)研究表明，止咳平喘是柿葉最主要也是被應(yīng)用最多的功效，臨床常用于咳喘，消渴及各種內(nèi)出血，臁瘡，也可以生津止渴，也可以活血止血。柿葉主要含有黃酮類、萜類、萘醌萘酚類、香豆素類、揮發(fā)性等化學(xué)成分[1]，以其提取物制成的腦心清片作為國家中藥保護(hù)品種應(yīng)用于臨床，同時(shí)，柿葉作為一種保健食品被制備成各種飲料和食品而廣泛應(yīng)用于我們的生活中，黃酮類是柿葉中所有活性成分中最主要的有效成分，可是其脂溶性與水溶性差強(qiáng)人意，二者都較差，從而也反映出了它本

身的這種理化性質(zhì)會(huì)使其生物利用度較低。大豆卵磷脂與難溶性藥物制成的磷脂復(fù)合物可有效地提高溶解度較低的藥物在體內(nèi)的吸收，可以顯著提高藥物進(jìn)入人體內(nèi)的吸收速率，從而達(dá)到一個(gè)很好的治療效果[2～4]。筆者以陜西富平產(chǎn)柿葉為原料，提取其中含有的總黃酮，并采用溶劑法制備了磷脂復(fù)合物，為進(jìn)一步研制柿葉新制劑和優(yōu)選出適宜的制備方法奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

在本次研究過程中對(duì)經(jīng)常使用較大型號(hào)的實(shí)驗(yàn)儀器型號(hào)和廠家進(jìn)行了如表1所示記錄和總結(jié)：

表1 實(shí)驗(yàn)中使用的儀器

1.2 藥品與試劑

柿葉 (采集于陜西富平，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王昌利教授鑒定為正品)；柿葉總黃酮(自制，以蘆丁為對(duì)照品測(cè)定含量為52%)，大豆卵磷脂(含氮量>99.8%，成都市科龍化工試劑廠)；甲醇、無水乙醇、四氫呋喃，乙酸乙酯等均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

據(jù)與筆者實(shí)驗(yàn)相關(guān)的文章描述[5～7]，影響磷脂復(fù)合物形成的因素主要有以下幾種：如我們所選取的反應(yīng)溶劑的類型、投入藥物的量和所投入磷脂的量的比例、反應(yīng)所需要的時(shí)間、反應(yīng)控制的溫度和藥物濃度等。以總黃酮與大豆卵磷脂結(jié)合程度作為評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)，并且采用單因素和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)柿葉總黃酮磷脂復(fù)合物制備條件進(jìn)行詳細(xì)的研究。

2.1 磷脂復(fù)合率計(jì)算方法[8]

柿葉中所含的總黃酮是一種難溶于有機(jī)溶劑氯仿的物質(zhì)，而磷脂及柿葉總黃酮磷脂復(fù)合物易溶于氯仿。用定量的總黃酮和磷脂在一定條件下進(jìn)行反應(yīng)，減壓干燥除去反應(yīng)溶劑，加入一定量的氯仿，待充分溶解磷脂及磷脂復(fù)合物后，過濾，并取少量的氯仿洗滌容器，分別收集濾液與沉淀，將沉淀干燥后稱重，并計(jì)算柿葉總黃酮與磷脂的復(fù)合率，計(jì)算公式如下：

復(fù)合率=[(總黃酮的初始投藥量-沉淀量)/總黃酮的初始投藥量]×100%

2.2 單因素影響試驗(yàn)

2.2.1 反應(yīng)溶劑種類考察 使用分析天平，取適宜量的總黃酮進(jìn)行精密稱定，使其與大豆卵磷脂按1∶4 (w/w)的比列來進(jìn)行投料，分別于不同反應(yīng)溶劑中進(jìn)行復(fù)合，控制溫度為50 ℃，反應(yīng)1.5 h，總黃酮的濃度為 5.0 mg·mL-1，磁力攪拌速度為120 r·min-1，計(jì)算總黃酮與磷脂的結(jié)合百分率，確定適宜反應(yīng)溶劑，實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行三次，結(jié)果見圖1A，我們可以清晰的看出以四氫呋喃作為該反應(yīng)的反應(yīng)溶劑時(shí)二者的復(fù)合率最高，最終確定四氫呋喃最符合我們的要求，為總黃酮最佳的反應(yīng)溶劑。

2.2.2 投料比考察 精密稱取總黃酮適量，以四氫呋喃為反應(yīng)溶劑，控制其他因素不變，分別對(duì)總黃酮與大豆卵磷脂投料比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4時(shí)的磷脂復(fù)合率進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行三次，結(jié)果見圖1B，從圖中我們可以清晰的看出復(fù)合率隨磷脂用量的增加而不斷上升，因此為了確保整個(gè)體系較高的復(fù)合率，我們確定了總黃酮和大豆卵磷脂的投料比最佳應(yīng)該為1∶4。

2.2.3 總黃酮濃度考察 精密稱取總黃酮適量，以為四氫呋喃反應(yīng)溶劑，投料比1∶4，控制其他因素不變，分別考察總黃酮濃度為2.5、5、10 mg·mL-1時(shí)的復(fù)合率，實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行三次，結(jié)果見圖1C，可知總黃酮濃度為5 mg·mL-1時(shí)復(fù)合率最高。

2.2.4 反應(yīng)溫度考察 精密稱取總黃酮適量，將四氫呋喃作為反應(yīng)的溶劑，使用最佳的藥物投料比為1∶4，實(shí)驗(yàn)過程中我們?nèi)〉目傸S酮濃度為5 mg·mL-1，控制其他因素不變，我們分別對(duì)25、40、50、60℃時(shí)的復(fù)合率進(jìn)行了考察，實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行三次，結(jié)果見圖1D，可以清晰的看到反應(yīng)溫度對(duì)體系的復(fù)合率影響較為顯著，且呈正比關(guān)系，但如果將溫度升高至50℃時(shí)復(fù)合率增加變得緩慢，因此我們可以確定適宜反應(yīng)溫度應(yīng)該為50℃。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果

2.2.5 反應(yīng)時(shí)間考察 精密稱取總黃酮適量，將四氫呋喃作為反應(yīng)溶劑，使用最佳的投料比1∶4，使用的總黃酮濃度為5 mg·mL-1，控制其他因素不變，在保持50℃不變的情況下，使其分別反應(yīng)1、1.5、2、3 h，然后計(jì)算其復(fù)合率，實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行三次，結(jié)果見圖1E，從圖中可以看出1.5 h 時(shí)反應(yīng)基本完全，同時(shí)也可以了解到復(fù)合過程受反應(yīng)時(shí)間因素的影響相對(duì)于其他因素而言是比較小的。

2.2.6 攪拌速度考察 精密稱取總黃酮適量，將有機(jī)試劑四氫呋喃作為其反應(yīng)溶劑，選用最佳投料比1∶4，使用的總黃酮濃度為5 mg·mL-1，將溫度控制在50℃，使其反應(yīng)1.5 h，分別將磁力攪拌速度設(shè)置為120、240、480、960 r·min-1時(shí)對(duì)其復(fù)合率進(jìn)行考察，結(jié)果見圖1F，我們可以清晰地看出當(dāng)設(shè)置的攪拌速度達(dá)到480 r·min-1時(shí)，體系中總黃酮的復(fù)合率將不再隨轉(zhuǎn)速的增加而提升。

綜上可知，反應(yīng)溶劑所選取的類型、各種投料所占比例、反應(yīng)所控制的溫度大小、總黃酮濃度對(duì)磷脂復(fù)合率有著顯著的影響，而對(duì)總黃酮的復(fù)合率的影響相對(duì)而言比較小的則是攪拌速度、反應(yīng)時(shí)間。

2.3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

結(jié)合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，我們以總黃酮與卵磷脂的投料比例、選取的總黃酮濃度以及反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度等作為影響因素進(jìn)行考察，以總黃酮磷脂復(fù)合率作為優(yōu)化制備工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)，并采用L9(34)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)考察，因素與水平表見表2。

將其因素與水平導(dǎo)入正交助手可以得出其相應(yīng)的均值1、均值2、均值3 以及極差，結(jié)果如表3 所示，我們可以清晰的看出均值 95.327 是比較大的，因此可以選出最佳的溫度為60℃，極差分析顯示，各因素對(duì)復(fù)合率的影響順序?yàn)锳>C>D>B。如表4方差分析結(jié)果所示，A因素，即反應(yīng)時(shí)間的影響具有顯著意義，溫度越高，復(fù)合率越高，故應(yīng)選擇A因素最高水平60℃。復(fù)合率會(huì)隨磷脂用量的增加而增加，但磷脂過多亦會(huì)引起復(fù)合物黏性大、制劑困難等缺點(diǎn)，因此我們選用了1∶3的投料比，從整體來看，反應(yīng)時(shí)間和其藥物濃度對(duì)復(fù)合率的影響并不是特別顯著，結(jié)合實(shí)際條件綜合權(quán)衡后，確定柿葉總黃酮磷脂復(fù)合物的最為適宜的制備方法為：取總黃酮適量，磷脂投料比1∶3(w/w)，選用濃度為5.0 mg·mL-1的總黃酮，以四氫呋喃為反應(yīng)溶劑，于60℃下，控制磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為480 r·min-1反應(yīng)1 h即得。

表2 因素與水平

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

稱取一定量的總黃酮，按照選取出的最佳制備工藝進(jìn)行制備磷脂復(fù)合物，并且進(jìn)行重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。可見，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果平均偏差為0.91%，表明我們選取的最佳制備工藝是穩(wěn)定且可行的。

3 討論

在反應(yīng)溶劑種類的考察過程中，將有機(jī)溶劑四氫呋喃作為反應(yīng)溶劑會(huì)比將無水乙醇作為反應(yīng)溶劑所得到的復(fù)合率均較高，但比較所得產(chǎn)物的性質(zhì)，四氫呋喃較好，因此我們選定了四氫呋喃為本次實(shí)驗(yàn)研究的反應(yīng)溶劑。磷脂用量較大時(shí)在溶液中濃度會(huì)比較高，因此會(huì)與藥物分子碰撞的機(jī)會(huì)也會(huì)隨之增多，我們得到的復(fù)合率會(huì)隨磷脂用量的增加而增多，但如果我們加入過多的磷脂亦會(huì)引起復(fù)合物黏性大，從而造成制劑困難等缺點(diǎn)，因此，筆者實(shí)驗(yàn)將投料比的考察范圍設(shè)定1∶1～5，通過正交實(shí)驗(yàn)考察，在確保復(fù)合完全的同時(shí)保證產(chǎn)物質(zhì)量的前提下，確定了總黃酮與磷脂投料最佳比為1∶3(w/w)。

磷脂復(fù)合反應(yīng)是吸熱反應(yīng)，溫度越高，其反應(yīng)速度越快快，反應(yīng)平衡常數(shù)越大，即理論復(fù)合率越高；但由于磷脂遭遇高溫時(shí)容易被破壞，因此在保證復(fù)合效率的前提下，我們將溫度設(shè)定為60℃較為適宜。

綜上，筆者實(shí)驗(yàn)通過正交實(shí)驗(yàn)確定了柿葉總黃酮磷脂復(fù)合物的最佳制備工藝，以期通過改善其難溶性而提高生物利用度，但筆者實(shí)驗(yàn)僅停留于工藝研究層面，尚需體外及體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。