正交法優(yōu)選木賊山奈素水解條件的研究

胡玲玲

(安康學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，陜西 安康 725000)

木賊(Equisetumhiemale):木賊科(Equisetaceae)木賊屬多年生草本植物的干燥地上部分，又名千峰草、筆頭草、節(jié)骨草等,為較常用的中藥材，分布于中國(guó)東北、華北、西北、西南及湖南、河南、湖北[1～5]。迄今為止，木賊科植物已發(fā)現(xiàn)有30多種，而木賊是《中國(guó)藥典》2000年版收載的品種，也是現(xiàn)今木賊屬唯一被藥典載入的植物[6]。其味甘、苦，性平，主要作用于肺經(jīng)、肝經(jīng)。具有祛風(fēng)散熱、明目眼睛、清除白內(nèi)障的功效。常用于治療風(fēng)熱感冒、紅眼病、白內(nèi)障，迎風(fēng)流淚等癥狀。據(jù)藥理研究表明，木賊還對(duì)心血管系統(tǒng)有很好的保護(hù)、修復(fù)作用[7]，能抗氧化、抗衰老[8、9]和保肝、鎮(zhèn)痛作用[8]，主要是因木賊中含有豐富的黃酮類化合物，黃酮類化合物對(duì)于治療疾病起著很重要的作用。山奈素屬于黃酮醇類，與黃酮類化合物具有相同的母核，且在木賊中山奈素為主要成分，故本實(shí)驗(yàn)可用山奈素作為指標(biāo)性成分[9]。山奈素的系統(tǒng)命名為：3,5,7-三羥基-4、-甲氧基黃酮，結(jié)構(gòu)式如圖1。

圖1 山奈素的結(jié)構(gòu)式

目前，測(cè)定植物黃酮類化合物含量的主要檢測(cè)方法有紫外分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)、雙波長(zhǎng)薄層掃描法等方法[10]。由于紫外分光光度法具有準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)[10]，且正交優(yōu)選水解條件的實(shí)驗(yàn)測(cè)試數(shù)據(jù)多，沒必要使用太過復(fù)雜的儀器或設(shè)備輔助。故筆者實(shí)驗(yàn)擬采用以山奈素為指標(biāo)性成分，通過紫外分光光度法測(cè)定山奈素含量，以此來比較木賊山奈素的最佳水解條件。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)所用主要儀器見表1。

1.2 試劑與樣品(表2)

表1 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

表2 實(shí)驗(yàn)試劑與樣品

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 山奈素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

用分析天平精確稱取2.10 mg的山奈素對(duì)照品，加少量無水甲醇[9]溶解，轉(zhuǎn)移到25 mL的容量瓶中，甲醇加至刻度線，搖動(dòng)使其混合均勻，既得山奈素標(biāo)準(zhǔn)溶液，其質(zhì)量濃度為84 μg·mL-1，置冰箱中備用。

2.2 供試品溶液的制備

將木賊樣品粉碎，過40目篩，精密稱取0.75 g，共9份，分別放置于50 mL具塞的圓底燒瓶中，加入75%乙醇25 mL并進(jìn)行稱重，連通球形冷凝管，用水浴鍋加熱回流，放冷后再次稱重，用75%的乙醇補(bǔ)足損耗的乙醇，搖勻過濾，量取濾液10 mL，加入濃鹽酸，進(jìn)行水解。水解液水浴蒸干，殘?jiān)?0 mL蒸餾水溶解后倒入60 mL分液漏斗中，用10 mL乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并萃取液，水浴使乙酸乙酯蒸干，將剩余殘?jiān)糠钟眉状既芙舛啻紊倭咳芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得木賊山奈素供試品溶液[6]。

2.3 最大吸收波長(zhǎng)的選擇和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2.3.1 最大吸收波長(zhǎng)的選擇 分別精密量取質(zhì)量濃度為84 μg·mL-1的山奈素標(biāo)準(zhǔn)溶液和山奈素供試品溶液各2 mL，甲醇溶液定容到5 mL的容量瓶中，得山奈素對(duì)照品溶液。打開L-5S紫外分光光度計(jì)，預(yù)熱30 min，取制得的山奈素對(duì)照品溶液，以無水甲醇為空白溶液調(diào)零，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，根據(jù)山奈素對(duì)照品溶液的最大吸收波峰，確定測(cè)定山奈素供試品液的最大吸收波長(zhǎng)[10～13]。由波長(zhǎng)掃描得，不管是山奈素對(duì)照品溶液，還是木賊山奈素供試品溶液，都在波長(zhǎng)365nm處有最大吸光度，呈現(xiàn)最大吸收峰，故選擇波長(zhǎng)365 nm為實(shí)驗(yàn)的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 用移液管精密量取84 μg·mL-1的山奈素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20 mL，0.40 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用無水甲醇稀釋至刻度線，制得1.68 μg·mL-1，3.36μg·mL-1，5.04μg·mL-1，6.72 μg·mL-1，8.40 μg·mL-1系列濃度的山奈素對(duì)照品溶液。以甲醇作為空白對(duì)照[10～13]，在最大吸收波長(zhǎng)下，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，并準(zhǔn)確記錄數(shù)值。繪制山奈素標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，縱坐標(biāo)為測(cè)定的吸光度(A)，橫坐標(biāo)為山奈素對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度( μg·mL-1)[13]。進(jìn)行回歸分析，得其回歸方程為y = 0.0828x - 0.0017， r =0.9992。木賊山奈素含量在1.68～8.40 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 木賊山奈素水解條件的正交設(shè)計(jì)

根據(jù)前期查閱文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)預(yù)情況[10～13]，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，安排三個(gè)因素：水解時(shí)間(min)、水解溫度(℃)和加入濃鹽酸的量(mL)，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平。用L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn) ，各因素水平見表3。

表3 木賊山奈素水解條件因素水平

2.5 木賊山萘素含量測(cè)定

精密量取2.2中制備的木賊山奈素供試品溶液1 mL轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加75 %甲醇溶解至刻度線，搖勻。在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，將吸光度平均值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得出的數(shù)值即為山奈素供試品溶液的質(zhì)量濃度。測(cè)定的結(jié)果及正交分析見表4和表5。由R值可知，各個(gè)因素對(duì)木賊山萘酚提取時(shí)的影響 ：加濃鹽酸量>水解時(shí)間>提取溫度，且C2>C1>C3，A1>A2>A3，B2>B3>B1，由此可見水解最佳條件為A1B2C2。表5的方差分析表中C因素的(加鹽算量)F0.05

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

由于正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出的工藝路線(A1B1D2)不在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中，因此需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。稱3份木賊粉，按優(yōu)選出的水解條件制備供試品溶液，結(jié)果見表6。

由表6可知，此條件下木賊山奈素的含量在5.721～6.248 ug·mL-1,平均含量為6.092 ug·mL-1。與實(shí)驗(yàn)2方案(A1B2C2)的含量接近。說明優(yōu)選出的工藝路線(A1B1D2:加鹽酸2.5 mL、60℃水解30 min)是木賊山萘素穩(wěn)定、合理、可行的水解條件。

表4 山奈素水解條件L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

注：D為空白項(xiàng)。

表5 山奈素水解條件方差分析

F(2、4)0.05=19，F(xiàn)(2、4)0.01=99。

表6 木賊山奈素的含量測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 討論

實(shí)驗(yàn)在提取木賊山奈素時(shí)考慮到提取溶劑甲醇毒性大，因而改用75%乙醇進(jìn)行提取，通過前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)75%的乙醇提取完全，得到木賊山奈素含量較高。且乙醇毒性小，因此最終采用75%的乙醇提取樣品。在測(cè)定各因素水平木賊山奈素含量時(shí)，紫外分光光度法測(cè)得的一系列結(jié)果一致程度好，具有準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。故筆者實(shí)驗(yàn)采用以山奈素為指標(biāo)性成分，通過紫外分光光度法測(cè)定山奈素含量，以此來比較優(yōu)選木賊山奈素的最佳水解條件。