CD133及CD44在肺癌組織中表達(dá)及其與臨床病理學(xué)特征和預(yù)后的關(guān)系

唐治蓉，龍瓊先，劉欣雅，廖文華，張旭乾

(南充市中心醫(yī)院 病理科，四川 南充637000)

肺癌是目前病死率占居世界首位的惡性腫瘤，具有發(fā)病率、增長(zhǎng)率、死亡率高和治愈率低的特點(diǎn)[1]。影像學(xué)診斷是肺癌患者選擇手術(shù)治療的主要依據(jù)，但患者早期發(fā)病隱匿，鑒別肺良性病變與肺癌有一定難度，致使錯(cuò)過最佳手術(shù)時(shí)間而延誤治療，患者五年生存率較低[2,3]。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)以延長(zhǎng)肺癌患者總生存期十分重要。肺癌干細(xì)胞(lung cancer stem cell，LCSC)是一類可自我更新、無限繁殖以及多向分化進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤形成的特殊細(xì)胞亞群，既往研究證實(shí)，LCSC可能參與肺癌發(fā)生、發(fā)展過程，為肺癌臨床治療的研究提供特異性治療靶點(diǎn)[4,5]。CD133、CD44是兩種常見的腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)標(biāo)志物，參與口腔鱗狀細(xì)胞癌[6]、結(jié)直腸癌[7]、卵巢癌[8]、前列腺癌[9]等多種腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程，但二者在肺癌中的聯(lián)合研究較少。本研究通過免疫組化和Western-Blot方法檢測(cè)CD133及CD44在肺癌組織中的表達(dá)情況，分析CD133及CD44表達(dá)與肺癌臨床病理特征間的關(guān)系，并探討二者表達(dá)情況與肺癌預(yù)后的關(guān)系，旨在為肺癌靶向治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

募集我院2011年12月至2013年12月收治的經(jīng)病理確診的73例肺癌患者病理標(biāo)本，同時(shí)募集對(duì)應(yīng)的病理證實(shí)無腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)的正常癌旁組織標(biāo)本61例，即刻冷凍保存。73例肺癌患者中男48例，女25例，年齡31-80歲，平均年齡(67.19±8.42)歲，低分化患者46例，中分化患者22例，高分化患者5例，淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移40例，無淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移33例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理確診為肺癌；②初治患者；③未合并肺部其它疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其它部位原發(fā)性腫瘤患者；②接受放化療治療；③伴有慢性感染性疾病患者；④妊娠或哺乳期女性。

1.2 方法

1.2.1免疫組化染色 石蠟包埋的標(biāo)本切片固定后脫臘水化，加入H2O2室溫孵育15 min。用PBS漂洗3次，共3 min，滴加5%BSA封閉1h，甩掉液體。加入一抗(CD133、CD44)后4℃冰箱過夜。PBS漂洗，甩干加入二抗，室溫孵育25 min，PBS沖洗，加入DAB染色，蘇木精對(duì)比染色1 min，脫水、透明、固定。結(jié)果判定：出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性，CD133、CD44陽(yáng)性為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占視野細(xì)胞總數(shù)的百分比×細(xì)胞著色深淺評(píng)分≥4分為陽(yáng)性。

1.2.2Western-Blot檢測(cè)CD133及CD44蛋白表達(dá)

對(duì)73例肺癌組織標(biāo)本和對(duì)應(yīng)的61例癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行蛋白提取，稱取50 mg組織樣品，加入液氮碾碎，再加入500 μl裂解液，2 000 g/min離心1 min，冰浴30 min，4℃離心機(jī)2 000 g/min離心15 min，取上清。用BCA法測(cè)定蛋白含量，進(jìn)行蛋白定量。取50 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、雜交，X線下顯影、成像。以檢測(cè)到清晰的條帶為有表達(dá)，記為“+”，無表達(dá)記為“-”，對(duì)應(yīng)的癌旁組織為對(duì)照。

1.3 隨訪情況

門診方式隨訪5年，截止日期2018年12月，第1年每3個(gè)月隨訪一次，之后每6個(gè)月隨訪1次，記錄肺癌患者總生存率和中位生存時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料用百分比(n，%)表示，比較用χ2檢驗(yàn)；生存分析用Kaplan-Meier法，生存率比較用Log-rank檢驗(yàn)，以(%)表示，P<0.05說明有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 肺癌和對(duì)應(yīng)癌旁組織中CD133及CD44免疫組化染色情況比較

CD133、CD44既表達(dá)于肺癌組織，也表達(dá)于對(duì)應(yīng)癌旁組織，在肺癌組織中主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色顆粒分布，CD133在肺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為60.27%(44/73)，在癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率為8.20%(5/61)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=38.85，P<0.05)；CD44在肺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為65.75%(48/73)，在癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率為11.48%(7/61)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=40.46，P<0.05)。見圖1。

圖1 肺癌和對(duì)應(yīng)癌旁組織中CD133及CD44免疫組化染色情況比較

2.2 肺癌和對(duì)應(yīng)癌旁組織中CD133及CD44蛋白表達(dá)情況比較

肺癌組織中CD133、CD44蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 肺癌和對(duì)應(yīng)癌旁組織中CD133及CD44蛋白表達(dá)情況比較[n(%)]

2.3 肺癌組織中CD133及CD44表達(dá)水平與臨床病理特征比較

鱗癌患者CD44表達(dá)水平明顯高于腺癌、小細(xì)胞癌患者(P<0.05)，發(fā)生淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移肺癌患者CD133及CD44表達(dá)水平明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)，CD133表達(dá)水平與肺癌患者性別、年齡、臨床TNM分期、腫瘤直徑、病理類型、分化程度無關(guān)(P>0.05)，CD44表達(dá)水平與肺癌患者性別、年齡、臨床TNM分期、腫瘤直徑、分化程度無關(guān)(P>0.05)。見表2。

2.4 CD133及CD44表達(dá)與肺癌患者預(yù)后關(guān)系

CD133、CD44陽(yáng)性患者與CD133、CD44陰性患者生存情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3，見圖2。

3 討論

正常情況下，細(xì)胞自我更新調(diào)控受到嚴(yán)格的程序性控制，一旦發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后，將破壞細(xì)胞自我更新調(diào)控機(jī)制平衡，另外，由于CSC具有自我更新、促使腫瘤形成以及維持腫瘤存在的特點(diǎn)，使得腫瘤產(chǎn)生異質(zhì)性，最終使得以手術(shù)為主的綜合治療預(yù)后欠佳[10,11]。因此，學(xué)者們認(rèn)為針對(duì)CSC進(jìn)行治療可能為腫瘤治療開辟新的途徑。LCSC是肺癌組織內(nèi)具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，在肺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。既往報(bào)道表明，CSC標(biāo)志物CD133、CD44可能對(duì)肺癌生物學(xué)特征以及患者預(yù)后有著重要影響[13]。

CD133是一種跨膜糖蛋白，廣泛表達(dá)于造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞以及各種正常組織干細(xì)胞中[14]。Wang等[15]報(bào)道指出，喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep2和TU-177中分離出的CD133+CD44+細(xì)胞群具有較高的細(xì)胞存活率以及較強(qiáng)的遷徙、轉(zhuǎn)移和集落形成能力，對(duì)順鉑和輻射具有較強(qiáng)的耐藥性，CD133+CD44+CSC有望成為喉鱗狀細(xì)胞癌抗腫瘤藥物和治療策略的新靶點(diǎn)。劉鑫等[16]研究證實(shí)，肺腺癌患者外周血CD133表達(dá)與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，其陽(yáng)性表達(dá)率為66.9%，可用于評(píng)估肺腺癌患者預(yù)后。本研究結(jié)果顯示，CD133在肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率60.27%顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織的8.20%，其表達(dá)與肺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者性別、年齡、臨床TNM分期、腫瘤直徑、病理類型、分化程度無關(guān)，且其在發(fā)生淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移肺癌組織中表達(dá)水平明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組織，表明CD133可能作為肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)指標(biāo)，在肺癌進(jìn)展過程中發(fā)揮作用，與既往報(bào)道相符。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，CD133陽(yáng)性患者生存率明顯低于陰性患者，表明CD133可能影響肺癌患者預(yù)后，且其高水平表達(dá)提示患者不良預(yù)后。

表2 肺癌組織中CD133及CD44表達(dá)水平與臨床病理特征比較[n(%)]

表3 CD133及CD44表達(dá)與肺癌患者預(yù)后關(guān)系

圖2 CD133及CD44表達(dá)與肺癌患者預(yù)后關(guān)系

CD44可促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)間的相互作用，并參與細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)因子在細(xì)胞表面組裝[17]。蔡傳書等[18]研究發(fā)現(xiàn)，CD44在非小細(xì)胞肺癌組織中過量表達(dá)，且其陽(yáng)性表達(dá)率越高，腫瘤細(xì)胞分化程度越低，提示CD44異常表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌發(fā)病有關(guān)。本文研究結(jié)果顯示，CD44在肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率65.75%顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織的11.48%，其表達(dá)與肺癌患者病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者性別、年齡、臨床TNM分期、腫瘤直徑、分化程度無關(guān)，且其在鱗癌組織中表達(dá)水平明顯高于腺癌、小細(xì)胞癌組織，在發(fā)生淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移肺癌組織中表達(dá)水平明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組織，可能與CD44在上皮中高水平表達(dá)有關(guān)，表明CD44與肺癌病理類型以及惡性程度緊密聯(lián)系。進(jìn)一步Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，CD44陽(yáng)性患者生存率明顯低于陰性患者。以上結(jié)果表明，其可能推動(dòng)肺癌發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，最終影響肺癌患者預(yù)后。越來越多報(bào)道顯示，CD133及CD44高表達(dá)細(xì)胞在體外具有較高侵襲能力、轉(zhuǎn)移能力，可通過影響腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移過程推動(dòng)腫瘤發(fā)展進(jìn)程，進(jìn)而影響腫瘤疾病轉(zhuǎn)歸[19,20]。

綜上所述，CD133及CD44與肺癌發(fā)生、發(fā)展密切聯(lián)系，二者高水平表達(dá)可能指示患者不良預(yù)后，有助于深入理解肺癌腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移分子機(jī)制，對(duì)尋找新的肺癌治療靶點(diǎn)、預(yù)后評(píng)估有一定的參考價(jià)值，值得學(xué)者后續(xù)研究探索。