番茄灰葉斑病抗性鑒定方法及抗病種質(zhì)資源篩選

徐成翠，張瑤瑤，鄭積榮，張敬澤，盧鋼*

(1.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310058； 2.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310024)

番茄(LycopersiconesculentumMill.)為茄科一年生草本植物[1]，原產(chǎn)于南美洲，在我國廣泛栽培，是中國最重要的蔬菜之一。番茄灰葉斑病是番茄的一種重要病害，病原為茄葡柄霉(Stemphyliumspp.)，屬半知菌亞門葡柄霉屬真菌，該病菌主要危害葉片，環(huán)境條件適宜時(shí)，還危害莖稈和果實(shí)，為害嚴(yán)重時(shí)，導(dǎo)致全部葉片變黃，被侵染的葉片逐漸變褐枯萎并從植株上脫落?；胰~斑病可導(dǎo)致番茄減產(chǎn)20%～80%，同時(shí)造成番茄果實(shí)質(zhì)量下降[2]。另外近年來受到番茄黃化曲葉病毒病的影響，很多地區(qū)都種植了抗病毒病品種，田間種植表明這些品種對(duì)真菌性病害尤其是灰葉斑病的抵抗能力較低，所以灰葉斑病已經(jīng)成為我國冬春季番茄的主要病害之一，給番茄生產(chǎn)帶來了不可低估的影響。

在適宜條件下，番茄灰葉斑病傳播極快，從發(fā)病到全株葉片感染只需2～3 d，利用化學(xué)防治難度較大，所以培育抗病品種是防治灰葉斑病既經(jīng)濟(jì)、有效又安全的措施。在番茄育種中對(duì)病原菌抗性鑒定和番茄抗源的篩選尤為重要，而鑒定方法的選用又是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本文從分離番茄灰葉斑病病原菌入手，建立早期抗性快速鑒定方法，并利用該方法對(duì)81份國內(nèi)外引進(jìn)的抗性種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定篩選，為番茄抗灰葉斑病品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄品種Micro-Tom、TH1353等用于比較不同抗病性鑒定技術(shù)，從國內(nèi)外廣泛引進(jìn)的78份番茄育種材料及3份雜交組合用于抗性資源鑒定。以上材料均由浙江大學(xué)蔬菜研究所番茄課題組繁殖保存。

番茄種子先用紗布包好，于55 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)浸種15 min，然后在常溫下浸泡4 h，取出置于28 ℃恒溫箱內(nèi)保濕催芽3 d直至種子露白，最后播于穴盤中(基質(zhì)配比為草炭土∶蛭石∶珍珠巖為3∶2∶1)，光、暗培養(yǎng)周期為16 h 28 ℃/8 h 23 ℃，光照強(qiáng)度為300 μmol·m-2·s-1。

1.2 病原菌分離和鑒定

1.2.1 病原菌的分離

從浙江省杭州蔬菜研究所大棚發(fā)病植株上采集具有典型癥狀的病葉，用于病原菌的分離。

組織分離法分離病原菌。剪取1 cm2見方的病健交界處有明顯病征的病葉，在10%NaClO中消毒3 min，無菌水漂洗3次，于無菌濾紙上晾干，擺放于PDA培養(yǎng)基上，置(25±2)℃黑暗中培養(yǎng)出菌落，取1 cm2見方菌塊置于新PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)[3]。

直接分離病原菌。用鑷子刮取少量表面物于無菌水中混勻，均勻涂抹在有網(wǎng)格狀標(biāo)記的瓊脂板培養(yǎng)基上，在顯微鏡下挑取茄匐柄霉單胞存在的培養(yǎng)基方格，置于PDA培養(yǎng)基上，在(25±2)℃，12 h/12 h光暗下培養(yǎng)，再進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.2 病原菌鑒定

病原菌孢子的鑒定。將純化菌種轉(zhuǎn)到PDA培養(yǎng)基上，在黑光燈照射和黑暗交替條件下培養(yǎng)產(chǎn)生孢子，在400倍顯微鏡下觀察。

接種鑒定。將分離的病原菌孢子懸浮液的孢子濃度稀釋至100倍顯微鏡視野上40個(gè)孢子(約8×105孢子·mL-1)，采用滴接法接種至番茄Micro-Tom葉片上，統(tǒng)計(jì)接種后葉片發(fā)病情況。采集發(fā)病的葉片進(jìn)行病原菌分離試驗(yàn)，與病原菌的菌落進(jìn)行對(duì)比。

1.3 番茄抗性鑒定方法比較

1.3.1 離體接種和活體接種

離體接種。不同番茄品種在溫室育苗，待長至4～5葉期剪取頂部向下第2～3葉片，流水沖洗后，無菌水沖洗3次，平鋪于預(yù)先鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿(9 cm×9 cm)中，采用涂抹法進(jìn)行接種，置于25 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，接種后第6天調(diào)查。

活體接種。對(duì)4～5葉期植株頂部向下第2～3葉片涂抹接種，控制相對(duì)濕度100%，溫度(25±2)℃，培養(yǎng)2 d后恢復(fù)正常培養(yǎng)，接種后第10天調(diào)查，分別計(jì)算病情指數(shù)。

1.3.2 噴霧和涂抹接種技術(shù)

不同番茄品系在溫室育苗，待長至4～5葉期摘取植株頂部向下第2～3葉片進(jìn)行離體抗病性鑒定。接種所用番茄灰葉斑病孢子懸浮液濃度為100倍顯微鏡視野約15個(gè)孢子(約3×105孢子·mL-1)。

噴霧接種。用噴壺將番茄灰葉斑病孢子懸浮液均勻噴霧于葉片至有水滴滴落，每片葉約接種0.2 mL。每個(gè)品系接種4株，重復(fù)3次。

涂抹接種。用毛筆蘸取番茄灰葉斑病孢子懸浮液對(duì)選取的葉片涂抹，每片葉約接種0.2 mL。每處理4株8片葉，重復(fù)3次。接種后第6天根據(jù)病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算病情指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

1.4.1 病情分級(jí)

根據(jù)灰葉斑病接種后病葉發(fā)病程度，參照Cho等[4]致病力分級(jí)方法進(jìn)行分級(jí)調(diào)查。番茄灰葉斑病病情分為5級(jí)：1級(jí)，葉片上無癥狀；2級(jí)，有黑色枯死點(diǎn)，占葉面積10%以下；3級(jí)，病斑面積占葉片面積的11%～20%；4級(jí)，病斑占葉面積21%～50%；5級(jí)，病斑占葉面積50%以上。

1.4.2 病情指數(shù)及抗病評(píng)價(jià)體系

病情指數(shù)=Σ[(該病級(jí)值×病級(jí)葉片數(shù))/(最高病級(jí)數(shù)×調(diào)查總?cè)~片數(shù))]×100%。

抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[5-6]方法，分為免疫(I，不表現(xiàn)癥狀，病情指數(shù)為0)、高抗(HR，0 <病情指數(shù)≤1.5)、中抗(MR，1.5<病情指數(shù)≤5)、中感(MS，5<病情指數(shù)≤25)、感病(S，25<病情指數(shù)≤100)，并將I、HR及MR歸為抗病，將MS和S歸為感病。

1.5 番茄抗源的篩選

從國內(nèi)外引進(jìn)78份番茄育種材料及3份雜交組合，共81份種質(zhì)資源用于抗性鑒定。當(dāng)番茄長至6～7葉期時(shí)，利用涂抹法進(jìn)行離體接種鑒定，接種部位為頂端向下第2～3片真葉展開，每處理4株8片葉，重復(fù)3次。接種后保濕24 h，接種6 d后調(diào)查病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的鑒定

通過顯微鏡觀察到，菌絲體初為白色，后漸呈暗褐色，以及清晰的病原菌孢子圖像，分生孢子多單生，倒短棒或橢圓形，頂端鈍圓、褐色、光滑，磚格狀分隔，一般有3個(gè)橫隔，1～3個(gè)縱隔膜，分生孢子大小為30～55 μm×13～25 μm。單胞茄匐柄霉菌培養(yǎng)時(shí)會(huì)有色素顯現(xiàn)，為黃褐色至紅褐色。接種到番茄Micro-Tom葉片上，結(jié)果表現(xiàn)為灰葉斑病癥狀(圖1)，證實(shí)所分離的病原菌為灰葉斑病致病菌。

2.2 抗病性鑒定方法比較

2.2.1 離體葉片與苗期活體接種法比較

由表1可知，比較苗期活體接種和離體葉片接種體系的病情指數(shù)大小發(fā)現(xiàn)，活體接種結(jié)果和離體接種結(jié)果基本一致。TY-1活體接種表現(xiàn)為高抗，離體接種表現(xiàn)為中抗；TY-25、T101F-201兩種接種方式下均表現(xiàn)為中抗；TY-11均表現(xiàn)為中感；但品系T101F-204在活體接種時(shí)表現(xiàn)為中感，在離體葉片接種時(shí)表現(xiàn)為感病。從4個(gè)品系的接種方法比較結(jié)果來看，離體接種后的病情指數(shù)比苗期活體接種平均增高1.3百分點(diǎn)，而在T101F-204品系中，病情指數(shù)增高12.8百分點(diǎn)，離體接種出現(xiàn)癥狀比活體接種更加明顯。2種接種方法的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.907 5，說明2種接種鑒定方法均可用于番茄灰葉斑病抗病性鑒定。

圖1 番茄灰葉斑病病原孢子分離與鑒定

表1 番茄苗期不同接種方法病情指數(shù)比較

2.2.2 涂抹法與噴霧法比較

由表2可知，2種接種方法均表現(xiàn)出噴霧法病情指數(shù)低于涂抹法，且涂抹法接種的品種間的病情指數(shù)差異更大，意味著對(duì)不同抗病性品種的區(qū)分度更高，且涂抹法不同重復(fù)間的標(biāo)準(zhǔn)誤更小，說明其更有利于減少操作誤差。

表2 不同接種方法病情指數(shù)比較

2.3 抗源篩選

試驗(yàn)表明，不同番茄品系間灰葉斑病的抗性差異很大。有的品系所有葉片均發(fā)病且十分嚴(yán)重，幾乎整個(gè)葉片發(fā)黃褐化。但采用同樣方法接種病原菌，且在相同培養(yǎng)條件下，部分材料的葉片幾乎不發(fā)病，也觀察不到病原菌，不同品系之間葉片發(fā)病的病情指數(shù)差異巨大。表3顯示，在接種的81個(gè)番茄自交系或雜交組合中，LA3528、LA3911、LA2823、CLN2264G、LA1802、LS-1306F、LS-1313F等7份材料表現(xiàn)出較強(qiáng)的番茄灰葉斑病抗病性，尤其是LA3528和LA3911為野生番茄材料，對(duì)番茄灰葉斑病高抗。LA3528、LA3911、LA2823、LA4285、LA1802均來自于美國種質(zhì)資源庫，CLN2264G來自于亞蔬中心，LS-1313F和Ty-1101為項(xiàng)目組保存的兩個(gè)自交系。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，TY-1138、TY-1147、TY-1116、TY-1142、TY-1108、TY-1123、TY-1144、N9021、T010-51是易感材料，病情指數(shù)在44.7%～75.3%，而這些材料大多含有黃化曲葉病毒病抗性基因。

3 小結(jié)與討論

番茄抗病材料的鑒定與篩選是抗病育種過程中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。簡便易行的接種體系的建立對(duì)番茄抗病材料的鑒定與篩選極為重要。從活體接種和離體的接種結(jié)果來看，兩種接種方法的結(jié)果基本一致，說明兩種接種鑒定方法均可用于番茄抗灰葉斑病資源篩選、品種(系)抗性鑒定，對(duì)于珍貴材料或者在番茄材料比較少的情況下，可以采用離體葉片接種的方法對(duì)材料進(jìn)行抗性鑒定，簡化育種的工作及流程。另外接種結(jié)果顯示，離體接種出現(xiàn)的癥狀比活體接種更明顯，因而對(duì)于篩選到的抗病品種可以采用離體接種的方法進(jìn)一步高效地篩選出高抗品種。葉片離體接種時(shí)采用涂抹法對(duì)于驗(yàn)證品種間抗病性的區(qū)分度更高，且涂抹法接種均勻，相對(duì)于噴霧法更容易控制試驗(yàn)變量，減少由操作引起的試驗(yàn)誤差。

接種試驗(yàn)共篩選出對(duì)灰葉斑病免疫的材料1份，高抗材料6份，中抗材料13份。感病品種的感病系數(shù)超過40%的極感病材料有13份，不同材料對(duì)番茄灰葉斑病的抗性差異明顯。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，雜交組合TY1101♀×LA2823♂與母本的抗病性表現(xiàn)一致，表現(xiàn)為中等抗性，可能父本的高抗基因?yàn)殡[性或者在細(xì)胞質(zhì)中遺傳。另外發(fā)現(xiàn)，TY-1138、TY-1147、TY-1116等是易感材料，病情指數(shù)在44.7%～75.3%，這些材料大多含有黃化曲葉病毒病抗性基因。據(jù)報(bào)道，山東壽光地區(qū)大面積推廣抗黃化曲葉病毒(TYLCV)病番茄品種后番茄灰葉斑病呈現(xiàn)出暴發(fā)流行趨勢(shì)[7]，劉國華[8]曾報(bào)道抗TYLCV的番茄品種灰葉斑病發(fā)病較重。目前在生產(chǎn)上推廣的抗TYLCV番茄品種，如迪芬尼、齊達(dá)利、迪利奧、金棚8號(hào)、金棚10號(hào)等均表現(xiàn)為對(duì)灰葉斑的感病性，且感病后發(fā)病速度快，影響番茄的品質(zhì)和產(chǎn)量[7]。本研究的抗性鑒定進(jìn)一步證實(shí)了抗TYCLV品種大多容易發(fā)生灰葉斑病，對(duì)番茄的生產(chǎn)造成較大危害，因而從國外引進(jìn)推廣抗TYCLV番茄品種時(shí)應(yīng)注意防治灰葉斑病，注重引進(jìn)品種的本土適應(yīng)性，同時(shí)應(yīng)加快選育兼抗品種[9-10]。

表3 番茄苗期活體接種灰葉斑病病原菌不同品種病情指數(shù)