一氧化氮對弱光脅迫下苗期及坐果初期辣椒生長和抗性相關(guān)指標(biāo)的影響

李 莉，田士林，*，姜 俊，宋 麗

(1.黃淮學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，河南 駐馬店 463000； 2.駐馬店市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，河南 駐馬店 463000)

在植物生長過程中，逆境脅迫是植物生長經(jīng)常要面臨的問題，輕微的脅迫植物可以通過自身的調(diào)控來緩解逆境帶來的不利影響，通常植物通過啟動抗氧化酶(SOD、POD、CAT)來抵御和清除活性氧，維持膜的穩(wěn)定性[1]；當(dāng)逆境脅迫超出植物自我調(diào)節(jié)能力時，植物體活性氧代謝失調(diào)從而導(dǎo)致自由基積累，并進一步導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷[1]。

光照不足是近年來設(shè)施園藝中常見的逆境脅迫。在弱光條件下，植物光合作用降低，葉綠素含量出現(xiàn)異常，這一現(xiàn)象常常與谷氨酰-tRNA還原酶基因(HEMA1)、葉綠素酸酯a氧化酶基因(CAO)、牻牛兒基牻牛兒焦磷酸基因(GGPP2)的失調(diào)密不可分[2]。GGPS2、CAO和HEMA1基因是調(diào)控植物進行光合作用的關(guān)鍵基因，GGPS基因表達(dá)水平的高低不僅會影響植物光合器官中類胡蘿卜素的合成，而且會影響類異戊二烯途徑中葉綠素等物質(zhì)的合成[2]；CAO基因是催化脫植基葉綠素a形成葉綠素b的唯一基因，在弱光脅迫下通過調(diào)控葉綠素b含量使植物更好地適應(yīng)弱光環(huán)境[3]；HEMA1基因是代謝和環(huán)境調(diào)控的關(guān)鍵酶基因，該基因受光誘導(dǎo)，在光合組織中表達(dá)[3]。弱光環(huán)境下，上述3個基因的變化可以反映植物對弱光環(huán)境的適應(yīng)能力[2-3]，基因表達(dá)的變化會導(dǎo)致葉綠素的合成受阻，最終影響蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。

近年來，隨著溫室大棚的廣泛應(yīng)用，蔬菜瓜果實現(xiàn)了周年供應(yīng)。受價格規(guī)律的影響，反季節(jié)蔬菜生產(chǎn)呈逐年上升的趨勢，然而，光照不足在大棚生產(chǎn)中最為常見[5]。辣椒屬于中光性植物，光照不足容易引起品質(zhì)降低[5]。因此，尋找一個簡單、快速、經(jīng)濟的栽培措施，用于緩解弱光對辣椒苗期生長所造成的不利影響至為重要。一氧化氮(nitric oxide，NO)既是一個氣態(tài)自由基也是一個多功能細(xì)胞信號傳導(dǎo)效應(yīng)器，在不同的生理過程中扮演著重要的作用[6]。研究表明，NO參與調(diào)控植物的抗病、氣孔關(guān)閉、非生物逆境脅迫、鐵離子平衡以及生長發(fā)育等方面[7]。硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)是外源NO的直接供體，利用SNP作為NO的發(fā)生器在植物逆境調(diào)控方面已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[8-9]。有研究表明，適當(dāng)濃度的SNP能有效緩解逆境對多種植物生長造成的傷害[8-12]。付娟娟等[13]選用冷季型草坪草高羊茅為材料，通過研究不同遮陰強度和不同遮陰時間對高羊茅的膜透性及抗氧化酶活性的影響，結(jié)果表明，外源NO可以顯著提高遮陰脅迫下高羊茅葉片的葉綠素含量，降低質(zhì)膜相對透性的增加，減少膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量的升高，促進脯氨酸的積累，提高超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的活性。外源NO能否減輕弱光環(huán)境對辣椒植株造成的傷害尚未見相關(guān)報道。本研究擬設(shè)置不同程度的遮陰處理(輕度遮陰LS、中度遮陰MS、重度遮陰SS)模擬弱光環(huán)境條件，采用SNP作為NO的供體，探討外源NO對遮陰辣椒苗期抗氧化系統(tǒng)的影響，為辣椒耐弱光遺傳資源的篩選及設(shè)施栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為光強敏型辣椒材料WM-1，為早熟品種，果實朝天簇生，株高30～40 cm，果實初期乳白，成熟后淺紅，微辣。每簇結(jié)5～6個果，果長4～5 cm，果徑1 cm左右，單果質(zhì)量3～4 g，坐果力強。種子由河南省辣椒核心種質(zhì)資源創(chuàng)制及分子育種創(chuàng)新團隊提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗布置

試驗于黃淮學(xué)院智能溫室內(nèi)進行。當(dāng)辣椒長出3～4片真葉時，移栽于花盆(20 cm×14 cm)，盆土成分為泥炭、沙子和珍珠巖(體積比1∶1∶1)，每盆1株，按照隨機區(qū)組設(shè)計布置。2周后，選出70株相同苗齡、相同高度、相同莖粗、相同葉片數(shù)、相同健康程度的辣椒苗為試材。其中，對照(CK)10株、輕度遮陰(LS)20株、中度遮陰(MS)20株、重度遮陰(SS)20株。每3 d澆一次霍格蘭營養(yǎng)液，每盆每次澆200 mL。

1.2.2 遮陰處理

智能溫室內(nèi)采用黑色透氣遮陽網(wǎng)進行遮陰，設(shè)置對照(CK)和3種遮陰處理(輕度遮陰、中度遮陰、重度遮陰)。對照(CK)光強，1 000 μmol·m-2·s-1；輕度遮陰(LS)光強，600 μmol·m-2·s-1；中度遮陰(MS)光強，300 μmol·m-2·s-1；重度遮陰(SS)光強，100 μmol·m-2·s-1。生長溫度：白天28 ℃/夜晚20 ℃，光照時間：白天10 h/夜晚14 h。

1.2.3 SNP配制及噴施

2000年11月，美國國會在水資源發(fā)展法中通過了大沼澤地綜合修復(fù)計劃。這是美國有史以來最大的環(huán)境修復(fù)工程，共有60個單項，計劃30年完成。該計劃的主要目標(biāo)：一是增加自然生態(tài)的空間面積，改善棲息環(huán)境及其相應(yīng)功能，增加原生態(tài)動植物種群的數(shù)量和多樣性；二是增加區(qū)內(nèi)工農(nóng)業(yè)及城鎮(zhèn)供水量，降低洪水災(zāi)害。修復(fù)計劃有四項主要措施：

SNP購自Sigma公司，使用前30 min用蒸餾水配成0.1 mmol·L-1SNP工作液[9]，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ刻煜挛?8:00進行噴施，用SNP溶液分別對輕度遮陰、中度遮陰、重度遮陰辣椒植株進行均勻噴施，每隔30 min噴施一次，連續(xù)噴施3次，分別對3組噴施過SNP溶液的遮陰植株進行掛牌，標(biāo)記為LS+SNP(輕度遮陰+SNP)、MS+SNP(中度遮陰+SNP)、SS+SNP(重度遮陰+SNP)。

1.2.4 樣品采集

從SNP噴施后的第5天開始，分別采集不同處理組辣椒葉片，帶回實驗室進行相關(guān)指標(biāo)測定。每5 d進行一次采樣，至第15天采樣結(jié)束。

1.2.5 相關(guān)指標(biāo)測定

SOD、POD、CAT活性的測定分別采用氮藍(lán)四唑(NBT)法、分光光度法和紫外吸收法[3]；葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b含量的測定采用葉綠素含量測定儀(SPAD502)；葉面積的測定采用數(shù)格子法：沿著葉子的形狀將其畫下來，畫在透明的坐標(biāo)紙上，然后數(shù)格子。計算格子時，葉片邊緣凡超過半格的計算為1，不足半格則不計數(shù)，根據(jù)數(shù)出的格子數(shù)就是葉片的面積數(shù)。以上所有指標(biāo)均重復(fù)測定3次，其結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

1.2.6 半定量RT-PCR

采用Trizol法提取辣椒葉片總RNA，用微量紫外分光光度計(ND-1000，美國)測定純度及定量(D260/D280、D260/D230)，-80 ℃保存。采用cDNA一鏈合成試劑盒(上海生工)，對純化后的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA一鏈，-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照半定量RT-PCR的要求，重復(fù)3次。根據(jù)辣椒基因組中GGPS2、CAO和HEMA1基因相對應(yīng)的CDS序列和Ubi3基因序列，設(shè)計半定量RT-PCR引物(表1)。

表1 引物序列

Table1Primer sequences used for qPCR

基因Gene 序列號Accession number引物名稱Primer name引物序列Sequence(5′→3′)GGPS2Capana04g000412GGPS2-FGGPS2-RTTGAAGCAGCACAGACGGCGAGAAGGGAATAACGCAOCapana00g004119CAO-FCAO-RGCCACGAGACAAGGAACAGAGTCGGGGATTGATAGTHEMA1Capana04g000804HEMA1-FHEMA1-RAGTTCTGGTGGAAATGTGACTGGATACTAAGCCCAATGACUbi3AY486137.1Ubi3-FUbi3-RGTTGTCTCTCGTCTACCTTGTCAGAATAACACGAACCCCAC

Ubi3用作內(nèi)參基因，F(xiàn)為正向引物，R為反向引物。

Ubi3 was used as internal control (reference gene); F， Forward primer; R， Reverse primer.

以PCR擴增出的條帶清晰可見為原則對模板濃度進行調(diào)整，將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA一鏈適當(dāng)稀釋至50 ng·mL-1，作為半定量RT-PCR模板。PCR擴增體系為15 μL：上游引物和下游引物(10 mmol·L-1)各0.5 μL，5×Buffer(含Mg2+)1.5 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)0.3 μL，Taq酶0.12 μL，模板cDNA 1.5 μL，ddH2O至10.58 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，溫度分別為48 ℃(HEMA1、CAO的引物)、47℃(GGPS2、Ubi3的引物)，72 ℃延伸1 min，26～28個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃終止反應(yīng)。取10 μL PCR產(chǎn)物分別點樣至1%瓊脂糖凝膠樣品孔中，在1×TAE電泳緩沖液中檢測PCR產(chǎn)物，全自動凝膠成像分析儀(上海培清JS-680C)照相分析電泳結(jié)果。

采用SAS (SAS Institute， version 8.2)對數(shù)據(jù)進行處理，采用SigmaPlot10.0軟件進行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP對弱光脅迫下辣椒植株生長狀況的影響

由表2可以看出，隨著遮陰加重，辣椒結(jié)果能力減弱、分枝降低、葉片稀而少；經(jīng)SNP處理后，植株的株高、莖粗、葉面積比遮陰植株顯著增加；在輕度遮陰條件下，SNP可以提高果實的質(zhì)量。值得提出的是：經(jīng)SNP處理過的中度遮陰(MS)和重度遮陰(SS)植株，植株的分枝數(shù)明顯增加。

表2SNP對遮陰處理下辣椒生長指標(biāo)的影響

Table2Effect of SNP on pepper growth indicators under weak light stress

材料Material株高Plant height/cm莖粗Stem diameter/cm葉面積Leaf area/cm2分枝數(shù)Number of branches 果實質(zhì)量Fruit weight/gCKLSLS+SNPMSMS+SNPSSSS+SNP38.53 b38.48 c38.87 a33.21 f33.72 d31.14 g33.42 e0.75 a0.72 b0.75 a0.58 d0.62 c0.46 e0.59 d35.73 a35.65 b35.72 a27.81 e29.81 c23.67 f28.12 d5 a5 a5 a2 c3 b1 d3 b3.22 a2.31 c3.20 b————

CK，對照株，正常光照；LS，輕度遮陰；MS，中度遮陰；SS，重度遮陰；LS+SNP，對輕度遮陰植株采用SNP處理；MS+SNP，對中度遮陰植株采用SNP處理；SS+SNP，對重度遮陰植株采用SNP處理。同列數(shù)據(jù)后無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。 “—”為未檢測到。

CK， The control (unshaded plants); LS， Light shaded treatment; MS， Moderate shaded treatment; SS， Severe shaded treatment; LS+SNP， SNP treatment on the light shaded plants; MS+SNP， SNP treatment on the moderate shaded plants; SS+SNP， SNP treatment on the severe shaded plants. Data marked without the same letters in the same column indicated significant difference atP<0.05. "—"， undetected.

2.2 SNP對不同弱光脅迫下辣椒幼苗SOD、POD和CAT活性的影響

從圖1-A中可以看出，處理第5、10、15天時，正常光照植株的SOD活性未發(fā)生明顯變化；不同程度遮陰處理后，辣椒植株SOD活性增加；與單獨遮陰處理相比，SNP處理后，遮陰植株葉片中的SOD活性普遍增加。說明SNP的施用提高了遮陰環(huán)境下辣椒植株的SOD活性，提高了弱光環(huán)境條件下辣椒的抗氧化能力。

從圖1-B中可以看出，遮陰處理后，取樣檢測結(jié)果表明，第5天、第10天、第15天對于正常光照植株來說，POD活性未發(fā)生明顯的變化；不同程度遮陰處理的辣椒植株P(guān)OD活性增加；與單純遮陰辣椒植株相比，采用SNP處理遮陰的辣椒植株，葉片的POD活性普遍增加。因此，SNP的施用提高了辣椒植株中POD活性，增強了弱光環(huán)境條件下辣椒的抗逆性。

從圖1-C中可以看出，遮陰處理后，取樣檢測結(jié)果表明，第5天，輕度遮陰未發(fā)生明顯變化，中度遮陰和重度遮陰經(jīng)SNP處理后效果明顯；第10天，無論是輕度遮陰、中度遮陰還是重度遮陰經(jīng)SNP處理后CAT活性明顯增加；第15天，除重度遮陰脅迫經(jīng)SNP處理后有輕微提高外，SNP處理15天時對遮陰植株CAT活性的提高已經(jīng)沒有影響，說明SNP處理有一定的時間效應(yīng)。因此，SNP的噴施提高了辣椒CAT活性，一定時期內(nèi)提高了弱光環(huán)境條件下辣椒的抗逆性。

圖1 SNP對不同弱光脅迫下辣椒幼苗SOD、POD和CAT活性的影響Fig.1 Effect of SNP on SOD， POD and CAT activity of pepper seedlings under different weak light stress

2.3 SNP對不同弱光脅迫下辣椒幼苗葉片葉綠素含量的影響

從圖2-A可以看出：第5天、第10天、第15天，相對于未噴施SNP辣椒植株來說，噴施SNP后辣椒葉片中的葉綠素a的SPAD值均表現(xiàn)為不同程度的提高，其中第15天SNP處理過的輕度遮陰植株葉綠素a的SPAD值與輕度遮陰植株差異顯著。因此，SNP的施用可以增強弱光脅迫下辣椒植株的抗逆能力。

從圖2-B可以看出：第5天、第10天，噴施SNP后辣椒葉片中的葉綠素b的SPAD值與未噴施SNP的遮陰植株相比均表現(xiàn)為不同程度的提高；噴施SNP后的第15天，辣椒葉片中的葉綠素b的SPAD值差異不顯著。

由圖2-C得知，第5天，SNP處理過的輕度遮陰和中度遮陰植株葉片中的葉綠素a+b的SPAD值略有提高，SNP處理過的重度遮陰植株葉片中的葉綠素a+b的SPAD值有不同程度的降低；第10天，SNP處理過的輕度遮陰和中度遮陰植株葉片中的葉綠素a+b的SPAD值略有提高，SNP處理過的重度遮陰植株葉片中的葉綠素a+b的SPAD值無顯著差異；第15天，SNP處理過的輕度遮陰、中度遮陰和重度遮陰植株葉片中的葉綠素a+b的SPAD值均有提高，但只有SNP處理過的輕度遮陰和中度遮陰葉綠素a+b值差異顯著；SNP提高了輕度遮陰和重度遮陰辣椒葉片中葉綠素a+b的SPAD值，對重度遮陰效果不明顯。

圖2 SNP對不同弱光脅迫下的辣椒幼苗葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of SNP on chlorophyll content in pepper leaves under different weak light stress

2.4 SNP對葉綠素合成相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

取不同處理的辣椒葉片1 μL總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳后，28S RNA和18S RNA條帶清晰，完整性較好，無明顯降解(圖3-A)。紫外分光光度計測得所提RNA的D260/D280值約為2.0，表明總RNA提取質(zhì)量較好，符合進一步RT-PCR的要求；確定適宜的循環(huán)次數(shù)是保證實驗結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素之一，本試驗以Ubi3為內(nèi)參基因[14]，在25～30個循環(huán)數(shù)內(nèi)來探索內(nèi)參基因和葉綠素酶基因的指數(shù)期，根據(jù)PCR電泳擴增結(jié)果(圖3-B)，確定了內(nèi)參Ubi3基因在28個循環(huán)時達(dá)到指數(shù)期，參試的3個葉綠素酶基因HEMA1、CAO、GGPS2對應(yīng)的指數(shù)期分別為26、28和27個循環(huán)，分別以上述循環(huán)數(shù)進行RT-PCR擴增；從圖3-C中可以看出，弱光脅迫后，與對照(CK)相比，植株葉片中的GGPS2基因、CAO基因和HEMA1基因表達(dá)水平增強，而噴施過SNP的辣椒植株3個基因的表達(dá)水平更強。由此可知，SNP處理促進了GGPS2基因、CAO基因和HEMA1基因的表達(dá)，增強了辣椒的耐弱光性。

3 討論

低溫弱光等環(huán)境因子是反季節(jié)設(shè)施蔬菜生產(chǎn)主要因素。在逆境脅迫下，植物形態(tài)特征變化可以直接反映植物的受傷害狀況，是評價植物抗逆性強弱的最直接指標(biāo)[4]。本研究中，遮陰導(dǎo)致辣椒植株葉片少、分枝差、植株生長勢弱；采用SNP處理后，處理組植株(MS+SNP和SS+SNP)長勢明顯好于遮陰組植株(MS和SS)。因此，對于反季節(jié)大棚辣椒，可以通過噴施SNP來緩解弱光對辣椒植株生長的影響。

A，RNA質(zhì)量；B，RT-PCR最佳循環(huán)數(shù)；C，相關(guān)基因表達(dá)水平。A， The quality of RNA; B， The optimal number of cycles for RT-PCR; C， The level of expression of related genes.圖3 HEMA1、CAO和GGPS2的表達(dá)水平的變化Fig.3 Changes in the expression levels of genes HEMA1， CAO and GGPS2

總之，在遮陰情況下，SNP能夠提高辣椒植株SOD、POD、CAT活性，增強了植株的耐弱光性；葉綠素a含量和葉綠素b含量的增加，提高了弱光環(huán)境下辣椒光合能力；同時，SNP處理也在一定程度上提高了葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平。這些結(jié)論表明：NO有利于弱光環(huán)境下辣椒抗性的提高和光合能力的恢復(fù)，對于弱光環(huán)境下辣椒的生產(chǎn)提供參考。